microbik.ru
  1 2 3

Качественные реакции на жиры.
Методы выделения жиров.
Обычно липиды извлекают из высушенных (обезвоженных) тканей соответствующими органическими растворителями (спирты, эфиры, бензол, толуол, бензин, ацетон, пиридин, хлороформ, четыреххлористый углерод, сероуглерод, петролейный эфир и др.). Для разделения липидов пользуются неодинаковой растворимостью их в различных растворителях: одни из них хорошо растворимы в эфире, но плохо в ацетоне (например, фосфолипиды), другие растворимы в бензоле, но не растворимы в спирте (холестерол, цереброзиды) и т.д. Резервный жир (масло) извлекается легко. Извлечь связанные липиды можно лишь после разрушения белково-липидных комплексов. Липиды из связанного состояния в свободное переводят либо путем применения гидролизующих средств, либо путем предварительного кипячения материала со спиртом. В последнем случае липиды выделяются в неизменном виде.

Наиболее простым методом определения суммарных липидов в тканях является метод длительного настаивания навесок ткани в хлороформ - метанольной смеси. По разности масс образца до и после экстракции находят процентное содержание липидов.

При выделении липидов из биологического материала происходит их окисление и деградация, приводящие к образованию побочных продуктов. Поэтому выделение липидов надо проводить быстро, в условиях, максимально исключающих влияние таких факторов, как повышенная температура, кислород воздуха, свет, загрязнение следами металлов и т.д.

Для экстракции используют смесь метанола и хлороформа, которая разрушает липопротеидные комплексы и тем самым дает возможность достаточно полно извлечь липиды.
Качественная реакция на жиры и масла.

К капле масла на часовом или предметном стекле добавляют одну каплю 1%-ного раствора осмиевой кислоты. Масло окрашивается в черный цвет. Кроме осмиевой кислоты, в качестве реактива на масла применяют краситель судан III, который окрашивает масла в различные оттенки красного цвета.

Для качественного обнаружения масла в продуктах срезы тканей (растительных или животных) смачивают одним из этих реактивов и наблюдают под микроскопом: капли масла в тканях окрашиваются в соответствующий цвет (черный от осмиевой кислоты или в красный — от судана III).
Обнаружение глицерина в жирах (акролеиновая проба)

В пробирку вносят 2-3 капли масла (жира) и прибавляют пятикратное количество безводного гидросульфата калия. Нагревают пробирку осторожно, но сильно (в вытяжном шкафу) до появления белых густых паров. Отмечают (осторожно!) резкий раздражающий запах акролеина. Если в эти пары внести кусочек фильтровальной бумаги, смоченной аммиачным раствором оксида серебра, бумага почернеет. Фильтровальная бумага, смоченная раствором фуксинсернистой кислоты, поднесенная к горлышку пробирки, постепенно окрашивается в розово-лиловый цвет.

Можно повторить этот опыт с воском вместо масла. Акролеин в этом случае не образуется.

Акролеиновая проба проводится для обнаружения в липидах глицерина. При нагревании глицерина в присутствии водоотнимающих средств (гидросульфат калия, сульфат магния, борная кислота) происходит образование непредельного акрилового альдегида — акролеина:

Определение насыщенности (ненасыщенности) жиров.

Ненасыщенность жира зависит от присутствия в его составе непредельных жирных кислот. Непредельные соединения, как известно, легко вступают в реакции присоединения, окисления, полимеризации. Обычно степень ненасыщенности определяют иодным числом. Иодное число измеряется количеством граммов иода, которое присоединяется к 100 г жира.

Для определения иодного числа титруют раствор жира в хлороформе (0,5 г жира в 3 мл хлороформа) 0,001н. раствором иода в хлороформе до появления отчетливой розовой окраски.

Качественные реакции на витамины.
Качественные реакции на витамин С (аскорбиновая кислота).

Качественные реакции на витамин С основаны на его способности легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать, например, метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол, гексациано-(III) феррат калия, нитрат серебра и др.
Взаимодействие с метиленовой синью.

К 1 мл сока (свежевыжатого или 0,002%-ного раствора аскорбиновой кислоты) в пробирке прибавляют 1 мл 0,01%-ного раствора метиленовой сини, перемешивают и закрывают пробкой для предохранения от соприкосновения с кислородом воздуха. Пробирку помещают в термостат при 37 - 40˚С. Через некоторое время жидкость в пробирке обесцвечивается за счет восстанавления метиленовой сини в бесцветную лейкоформу и образования дегидроаскорбиновой кислоты.

Если затем бесцветный раствор метиленовой сини энергично встряхнуть, не препятствуя поступлению воздуха в пробирку, то раствор вновь приобретает синий цвет.
Взаимодействие с гексациано-(III) ферратом калия

Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавливает гексациано-(III) феррат калия K3[Fe(CN)6] до гексациано-(II) феррата калия K4[Fe(CN)6], который с ионом железа в степени окисления +3 образует в кислой среде берлинскую лазурь.

К 1 мл сока прибавляют 2 капли 5%-ного раствора гидроксида калия, 2 капли 5%-ного раствора гексациано-(III) феррата калия и энергично встряхивают содержимое пробирки. Затем добавляют 6-8 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и 1-2 капли 1%-ного раствора хлорида железа(III). Выпадает синий осадок берлинской лазури.

Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом.

К 1 мл сока прибавляют 1 мл 0,02%-ного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенол. Тщательно перемешивают, раствор обесцвечивается за счет образования лейкоформы индикатора. При дальнейшем прибавлении индикатора раствор окрашивается в розовый цвет, так как вся аскорбиновая кислота в пробе уже окислена и 2,6-дихлорфенолиндофенол больше не восстанавливается.

Реакция с иодной водой

При добавлении к раствору, содержащему витамин С, 0,1%-ного раствора I2 в KI наблюдается обесцвечивание иодной воды.
Количественное определение аскорбиновой кислоты в исследуемом материале осуществляют с помощью 2,6-дихлорфенолиндофенола, используя его титрованный раствор. По количеству реактива, израсходованного на окисление витамина С, определяют содержание последнего в анализируемом материале.

Известна методика количественной оценки аскорбиновой кислоты по результатам титрования исследуемого раствора стандартным раствором иода в присутствии серной кислоты.

Определение ионов железа в пищевых продуктах.
Железо является одним из элементов человеческого организма. В случае большого недостатка железа в организме возникает заболевание – железодефицитная анемия (малокровие), так как основная часть входящего в состав организма железа сосредоточена в красных кровяных тельцах (эритроцитах), каждая из которых содержит 280 млн. молекул гемоглобина – дыхательного пигмента. Железо содержится в мышечном белке, во многих ферментах. Главное депо железа – печень: здесь у взрослого человека может быть запасено до 1 г железа. В организме взрослого человека всего 3,5 г железа. Избыточное количество железа приводит к образованию нерастворимого в воде железосодержащего белка. Этот белок уже не может быть использован организмом и, откладываясь в тканях и органах, вызывает нарушение их функций и приводит к заболеванию.

Ионы железа были обнаружены в молоке, клубничном соке, соке красной смородины, соке черной смородины, соке крыжовника, яблочном соке, соке крапивы, в гречневой крупе, мясном соке, в шоколаде, в меде, кураге, изюме, говяжьей печени, фасоли.

Для обнаружения иона железа в молоке 50 мл его упаривают до объема 5-7 мл. Мед и шоколад берут на кончике ножа и растворяют в 2 мл воды. Чайную ложку гречневой крупы размельчают в ступке, кипятят с 10 мл воды, отфильтровывают. Фильтрат упаривают до объема 2 мл.

На хроматографическую бумагу, на расстоянии 1 см от края, на линию старта наносят капилляром каплю 1-3%-ного раствора хлорида железа(III) в качестве свидетеля. Диаметр пятен должен быть не более 5 мм. На расстоянии 1 - 1,5 см от этого пятна наносят на линию старта исследуемые вещества: каплю сока яблока, сока клубники, красной смородины, крыжовника и др. Для большего концентрирования ионов железа пробу сока наносят несколько раз, касаясь капилляром одного и того же места на стартовой линии и дожидаясь улетучивания растворителя из предварительной пробы.

Опускают приготовленную хроматограмму с нанесенными пробами в прибор для бумажной хроматографии так, чтобы смесь растворителей (элюент), состоящая из этанола и разбавленной вдвое соляной кислоты в соотношении 1:4, касалась нижнего края бумаги, но была не выше стартовой линии.

Наблюдают за подъемом элюента по бумаге. Вынимают хроматограмму из камеры, когда фронт элюента будет находиться на расстоянии 0,5 см от верхнего края хроматограммы. Слегка подсушивают ее и опрыскивают из пульверизатора 10%-ным раствором гексациано-(II)-феррата калия для обнаружения ионов Fe3+ вначале в том месте, куда должен был «пробежать» хлорид железа(III), а затем на этом же расстоянии от линии старта и остальные пробы. Появляется синее окрашивание – образование берлинской лазури. Хроматографическая подвижность ионов железа(III) – Rf =0,87 – близка к единице.

Обнаружение β-каротина в пищевых продуктах методом ТСХ.
β-каротин необходим детям для роста и сохранения хорошего зрения.

β-каротин содержится в зелени петрушки, зелени лука, шпината, морковке, рябине.

Готовят бензольные вытяжки из продуктов. Для этого растирают пестиком мякоть продуктов в присутствии тертого стекла в ступке, затем раствор декантируют или фильтруют.

На линию старта силуфоловой пластины наносят капли исследуемых растворов, помещают их в хроматографическую камеру. Элюент (система растворителей) – бензол : ацетон (3:1). (Тяга, беречь от огня!).

β-каротин имеет оранжевую окраску, поэтому специально обнаруживать его не надо. Полученные в этих условиях значения хроматографической подвижности близки к литературным данным, Rf =0,9.

При одновременном хроматографировании бензольных растворов одинаковой концентрации разных продуктов можно сделать вывод о количественном содержании β-каротина по величине пятна.
Обнаружение кофеина в пищевых продуктах (чае, кофе) методом ТСХ.

Кофеин – алкалоид, бесцветное кристаллическое вещество. В небольших дозах оно повышает работоспособность. На этом основано широкое применение чая, кофе, какао, содержащих кофеин.

Приготовить раствор чая и кофе одинаковой концентрации в воде.

Нанести пробы на силуфоловые пластины. Пластины поместить в хроматографическую камеру. Элюент – этанол. Хроматографирование идет 10 мин. Обнаружить кофеин парами иода. Rf кофеина - 0,57. Если нет свидетеля кофеина, то следует ориентироваться на литературные величины Rf в этих же условиях хроматографирования.

Из хроматограмм видно, что кофеина в чае примерно в три раза больше, чем в кофе. В зеленом чае кофеина больше, чем в черном.
Практикум

по обнаружению биологически активных веществ в продуктах питания
1. Качественное определение белка c помощью ксантопротеиновой реакции.

Реактивы и материалы:

образец сырого продукта - 5 г ( один из перечисленных: мясо курицы, утки, филе рыбы),

вода,

раствор хлорида натрия 10%, 10 мл.

концентрированная азотная кислота в капельнице с пипеткой (5 мл).

Оборудование:

предметные стекла или чашки Петри (1 штука – на один продукт),

пробирка,

стакан на 100 мл,

воронка
фильтр бумажный,

пробиркодержатель,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор.

Особенности проведения реакции:

Опыт можно провести двумя способами.

В первом варианте используют образцы сырых продуктов, поместив их на чашку Петри или предметное стекло. Надо капнуть на образец мяса или рыбы каплю концентрированной азотной кислоты и подождать 1-2 минуты до появления в месте контакта продукта с кислотой характерного желтого окрашивания.

Во втором варианте используют раствор белка. Для этого 5 г мяса или рыбы мелко измельчают (можно после мясорубки), помещают в стакан, добавляют 10 мл 10%-ного раствора хлорида натрия и оставляют смесь стоять 10-15 минут при частом перемешивании, после чего отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр. В данном растворе содержится главным образом альбумин и глобулин. С раствором белка проводят классическую ксантопротеиновую реакцию при нагревании (см. стр. 5)


    1. Качественное определение белка с помощью биуретовой реакции.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы - 5 г (один на выбор: молоко, сыр, грецкие орехи, помидор, творог);

вода,

насыщенный раствор сульфата аммония — 5 мл,

раствор хлорида натрия 10%, 10 мл,

раствор гидроксида натрия (6N) - 10 мл,

раствор сульфата меди (0,5N) – 3 мл,

Оборудование:

нож или терка для измельчения,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор,

демонстрационные пробирки — 2 штуки,

стакан на 100 мл,

палочка стеклянная,

пробиркодержатель.

Особенности проведения реакции:

Можно использовать образец молока без выделения из него альбуминов. А можно добавить к образцу молока равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. При этом выпадают в осадок глобулины и казеин. После фильтрования через бумажный складчатый фильтр получают раствор альбуминов.

Из других продуктов готовят водную или солевую вытяжку. Для этого продукт измельчают, заливают 10 мл дистиллированной воды или 10 мл раствора соли, настаивают 10-15 минут, декантируют или фильтруют.

Если использован раствор белка, реакция проходит быстро уже при обычных условиях. (см. стр. 3)


    1. Качественное определение восстанавливающих углеводов. Реакция Троммера.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы - 5 г (один на выбор: мед, виноградный сок, свежевыжатый сок ананаса, капуста, огурец, помидор);

вода,

раствор гидроксида натрия (6N) - 10 мл,

раствор сульфата меди (0,5N) – 3 мл,

Оборудование:

нож или терка для измельчения,

марлевая салфетка для отжима сока,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор, демонстрационные пробирки — 2 штуки,

пробиркодержатель.

Особенности проведения реакции:

Эта реакция проходит легко с любым свежевыжатым соком. Если для реакции использован мед, есть вероятность отрицательной реакции Троммера в случае, если пчел «кормили» сахарным сиропом. Такой же результат может быть, если использован сок, приготовленный с большим количеством сахара.

При выполнении этого опыта особенно важно наличие сильнощелочной среды и умеренное нагревание (лучше всего — водяная баня) из-за возможности разложения гидроксида меди (II). (см. стр. 7)


    1. Качественное определение кетоз. Реакция Селиванова.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы - 5 г или 5 мл (один на выбор: мед, свежевыжатый виноградный сок, свежевыжатый сок ананаса);

фруктоза — 1 г,

глюкоза -1 г,

реактив Селиванова (0,05 г резорцина растворяют в 100 мл разбавленной (1:1) соляной кислоты) -3 мл

Оборудование:

водяная баня, нагретая до 80ºС,

демонстрационные пробирки — 2 штуки,

пробиркодержатель.

Особенности проведения реакции:

Реакция проходит легко при точном соблюдении инструкции (см. стр. 8).



<< предыдущая страница   следующая страница >>