microbik.ru
  1 2 3 4 5

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ



Системы РНК-сайленсинга в герминальных

клетках дрозофилы
В.А. Гвоздев

Лаборатория биохимической генетики животных

Отдела молекулярной генетики клетки (ОМГК)
Выявлены различия в механизмах сайленсинга мобильных элементов в герминальных и соматических клетках яичников. Показано участие в сайленсинге в герминальных клетках ряда генов системы РНК-интерференции (РНКи), которые не требуются для подавления экспрессии мобильных элементов в соматических клетках. Обнаружена роль некоторых из этих генов в обеспечении ядерной локализации белка PIWI, связывающего короткую piРНК и обладающего эндонуклеазной активностью в отношении мишени piРНК. Продолжены исследования на модели сайленсинга генов Stellate. Выявлен посттранскрипционный механизм сайленсинга и обнаружено участие ядерного компартмента клетки в этом процессе. На примере сайленсинга искусственных конструкций, содержащих последовательности Stellate, показано сходство характера сайленсинга Stellate, вызываемого piРНК in vivo и siРНК in vitro в культуре клеток. Показано метилирование ядерной фракции белка Stellate, позволяющее предполагать причины дефектного поведения хромосом при сверхэкспрессии этого белка. Исследуется роль транспозонов типа хелитронов в эволюции мультигенного семейства Stellate и его предшественников у родственных видов дрозофил.
Исследование механизмов контроля продолжительности жизни у дрозофилы
Е.Г. Пасюкова

Лаборатория геномной изменчивости ОМГК
Продолжительность жизни является одним из наиболее биологически и социально значимых признаков организма. Продолжительность жизни может сильно отличаться в разных популяциях и у разных особей одного вида. Изучение генетических факторов, лежащих в основе такой изменчивости, представляет большой интерес для понимания причин и условий, обеспечивающих высокую продолжительность жизни.

В 2008 году была завершена молекулярная характеристика реверсий и новых мутаций в генах esg и crol, регулирующих развитие и функционирование нервной системы и участвующих в контроле продолжительности жизни. Подтверждено получение одной истинной реверсии для каждого гена. Охарактеризованы размер, последовательность нуклеотидов и местоположение делеций и инсерций, вызвавших новые мутации в генах. В линиях с инсерционными мутациями, в соответствующей контрольной линии без инсерций и в линиях с истинными реверсиями дополнительно охарактеризована продолжительность жизни самцов и самок. Полученные результаты окончательно подтвердили роль генов crol и esg в контроле продолжительности жизни. Показано, что изучаемые инсерционные мутации замедляют старение.

Был продолжен анализ ассоциации природного полиморфизма генов stc и Lim3, регулирующих развитие и функционирование нервной системы, с изменчивостью продолжительности жизни и уровнем экспрессии генов. Выявлена достоверная (P=0,0005) ассоциация между продолжительностью жизни и гаплотипом, включающим три полиморфных сайта, расположенных в регуляторной области гена Lim3. Исследована ассоциация данного гаплотипа с уровнем экспрессии гена Lim3. Наименьший и наибольший уровень экспрессии выявлен в линиях, характеризующихся минорными гаплотипами и низкой продолжительностью жизни. Линии с мажорными гаплотипами характеризуются высокой продолжительностью жизни и средним уровнем экспрессии гена Lim3.

В рамках проекта «Практическое использование ионов Скулачева» в лаборатории было продолжено исследование влияния иона Скулачева (SkQ1) на продолжительность жизни Drosophila melanogaster. SkQ1 представляет собой вещество, состоящее из положительно заряженного иона трифенилфосфония (TPP) и пластохинона (PQ), соединенных цепочкой из метильных групп, способное проникать через заряженную мембрану митохондрий и обладающее антиоксидантными свойствами. Ранее мы показали, что продолжительность жизни самок и самцов линии w1118, получавших SkQ1 в концентрации 20 пМ в течение всей жизни, увеличивалась примерно на 10%, в то время как предшественники SkQ1, TPP и PQ, а также их смесь не оказывали влияния на продолжительность жизни мух. Наиболее интересный результат заключался в том, что максимальное влияние SkQ1 оказывал на смертность в раннем возрасте. Этот результат подтвержден в исследованиях на большой выборке, позволяющей исследовать кривые смертности. Показано, что кривая смертности контрольных самок описывается формулой Гомпертца, в то время как кривая смертности самок, получавших SkQ1 – формулой Вэйбла. Показано, что однократное применение SkQ1 в начале жизни дает тот же эффект, что его применение в течение всей жизни. Исследовано влияние SkQ1 на продолжительность жизни скрещивавшихся самцов и самок и их плодовитость.
Контакт с ядерной ламиной приводит к сайленсингу слабо экспрессирующихся генов,

но не влияет на транскрипцию активно экспрессирующихся генов
Ю.Я.Шевелев

Лаборатория анализа регуляции генов ОМГК
Согласно биоинформатическому анализу хроматин в области выявленных в геноме дрозофилы 74 кластеров семенник-специфичных генов существенно (в 7 раз) обогащен участками контакта с ядерной ламиной. Три четверти семенник-специфичных кластеров несут участки контакта с ламиной. Ранее было показано (Pickersgill et al (2006) Nat. Genet. 38:1005-1014), что в участках контакта с ламиной находятся преимущественно молчащие гены. На модельной системе семенник-специфичного кластера из сайта 60D нами обнаружено, что при искусственно вызванном истощении ламина B-типа (ламина DmO) в культуре клеток дрозофилы происходит усиление транскрипции 17 расположенных подряд, слабо экспрессирующихся генов, находящихся в контактирующем с ламиной участке хромосомы. Как показал FISH-анализ, усиление транскрипции этих генов при истощении ламина сопровождается примерно двукратным снижением числа клеток, в которых данный хромосомный район локализуется на периферии ядра. Следовательно, слабо экспрессирующиеся гены, расположенные в ламина-ассоциированных районах хромосом, подвергаются репрессии со стороны ядерной ламины.

В культуре клеток дрозофилы в ламина-ассоциированных районах обнаруживается небольшой процент активно экспрессирующихся генов. Анализ показал, что на уровень транскрипции трех случайно выбранных экспрессирующихся генов, которые находятся в разных ламина-ассоциированных районах хромосом, нарушение ядерной ламины не влияет. Аналогичным образом у мух, мутантных по ламину DmO, гены из района 60D, которые не экспрессируются в соматических тканях имаго, усиливают транскрипцию при мутации по ламину, а экспрессирующиеся гены не меняют уровень транскрипции. Следовательно, существует механизм, позволяющий активно экспрессирующимся в той или иной ткани генам избегать репрессии ламиной, находясь при этом в непосредственной близости от нее.

В клетках зародышевой линии самцов дрозофилы на определенном этапе дифференцировки происходит открепление ламина-ассоциированного участка хромосомы из сайта 60D от ядерной периферии, что совпадает с началом активной транскрипции семенник-специфичных генов этого района. Таким образом, связь ламина-ассоциированных участков хромосом с ядерной периферией может теряться в ходе дифференцировки клеток.
Изменчивость основных тандемных повторов ДНК в геномах различных видов дрозофилы
В.Е. Алаторцев

Сектор генных взаимодействий ОМГК
Значительная часть геномов эукариот представлена образующими гетерохроматин множественными тандемными повторами ДНК, которые выполняют целый ряд исключительно важных функций в геноме. Cеквенированы геномы 12 видов дрозофилы и проведено сравнение эухроматических частей геномов, однако сравнительный анализ образующих гетерохроматин повторов ДНК не проводился. Для выявления и классификации основных тандемных повторов ДНК в секвенированных геномах дрозофилы из массивов прочитанных последовательностей ДНК были отобраны нуклеотидные последовательности ДНК, содержащие тандемные повторы с длиной мономера до 500 нуклеотидных пар. Полученные для геномов 12 видов дрозофилы выборки тандемных повторов ДНК были использованы для характеристики наиболее часто встречающихся повторов ДНК. Оказалось, что в случае геномной сборки D.melanogaster основные тандемные повторы ДНК соответствуют описанным ранее сателлитным ДНК. Следовательно, их можно рассматривать как геномный эквивалент сатДНК. Оценки, сделанные с использованием полученных выборок тандемных повторов, показывают, что доля тандемных повторов в геномных сборках составляет от 2% у D.simulans до 18% у D.ananassae и у D.grimshawi. Картины распределения тандемных повторов видоспецифичны: у каждого вида есть характерные основные тандемные повторы определенной длины и нуклеотидного состава. Сходство в картинах распределения повторов есть только у D.pseudoobscura и D.persimilis, а также у D.simulans и D.sechellia, то есть у недавно разошедшихся видов. Время, как возникновения, так и исчезновения, коротких тандемных повторов у D.melanogaster, D.simulans и D.sechelliaне более нескольких миллионов лет. Выявленные основные тандемные повторы ДНК в 12 геномах дрозофилы могут быть использованы в дальнейшем для изучения структуры и функций гетерохроматина у дрозофилы.

Публикации Отдела молекулярной генетики клетки

(ЛБГЖ, ЛАРГ, ЛГИ, СГВ):
1. Рощина М.П., Логинова Н.Н., Девин А.Б., Гвоздев В.А. Гетерохроматиновые повторы ДНК дрозофилы и нетрадиционный сайленсинг генов в клетках дрожжей. Генетика, 2008, 44, 752-760.

2. Рязанский С.С., Гвоздев В.А.. Короткие РНК и канцерогенез. Биохимия, 2008, 73, 5, 642-657.

3. Симоненко А. В., Рыбина О. Ю., Пасюкова Е. Г. Молекулярная изменчивость генов shuttle craft и Lim3, контролирующих развитие нервной системы, в природной популяции Drosophila melanogaster. Генетика, 2008, 44, 1172-1177.

4. Анисимов В.Н., Бакеева Л.Е., Егормин П.А., Филенко А.Ф., Исакова Е.Ф., Манских В.Н., Михельсон В.М., Пантелеева А.А., Пасюкова Е.Г., Пилипенко Д.И., Пискунова Т.С., Попович И. Г., Рощина Н.В., Рыбина О.Ю., Сапрунова В.Б., Самойлова Т.А., Семенченко А.В., Скулачев М.В., Спивак М В., Цыбулько Е.А., Тындык М. Л., Высоких М. Ю., Юрова М. Н., Забежинский М. А., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. SkQ1 увеличивает продолжительность жизни и предотвращает развитие признаков старения. Биохимия, 2008, 73, 1655-1670.

Регуляция антисмысловой транскрипции ретротранспозонов Drosophila
А.И.Калмыкова

Группа исследования геномных повторов эукариот

Теломеры Drosophila образуются в результате транспозиций специфических теломерных ретротранспозонов HeT-A, TART и TAHRE на конец хромосомы. Смысловые транскрипты теломерных элементов являются мишенью особого пути РНК-сайленсинга, работающего в герминальных тканях, piРНК (PIWI interacting РНК) пути. Этот механизм регулирует уровень экспрессии смысловых транскриптов и частоту транспозиций теломерных элементов на конец хромосомы, осуществляя тем самым контроль длины теломер у Drosophila. Эта регуляция осуществляется посредством антисмысловых коротких РНК, что подчеркивает роль антисмысловой транскрипции в работе данного механизма. Мы обнаружили, что теломерный ретроэлемент НеТ-А транскрибируется в обоих направлениях за счет активности двунаправленного промотора, расположенного в его 3’нетранслируемой области. Некодирующие антисмысловые транскрипты НеТ-А подвергаются сплайсингу. Исследование коротких РНК, специфичных для теломерных элементов, выявило наличие как антисмысловых, так и смысловых piРНК в яичниках дрозофилы. Наличие смысловых коротких РНК указывает на то, что длинные антисмысловые РНК могут быть также мишенью РНК-интерференции. Мы показали накопление антисмысловых транскриптов HeT-A и TART в ядрах питающих клеток у мутантов по генам spn-E, aubergine и vasa, кодирующим компоненты piРНК пути. Таким образом, впервые показано, что не только смысловые, но и антисмысловые транскрипты являются мишенью системы РНК-интерференции.
Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы. Происхождение и эволюция детерминант устойчивости к антибиотикам
А.В. Кульбачинский

Лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов ОМГК
Бактериальная РНК-полимераза (РНКП) – сложная молекулярная машина, способная к разнообразным структурным перестройкам, которые происходят в ходе узнавания промоторов и инициации синтеза РНК, при присоединении нуклеотидов на стадии элонгации, а также в процессе терминации транскрипции. Мы исследовали роль двух эволюционно-консервативных конформационно-подвижных районов РНКП – участков switch2 и F-петли -субъединицы, – на разных стадиях транскрипции.

Первый из этих районов (switch2) соединяет подвижный домен clamp («зажим») с основной частью молекулы РНКП, а также непосредственно контактирует с ДНК спереди от активного центра РНКП. Как предполагается, домен clamp обеспечивает «закрывание» нуклеиновых кислот внутри главного канала РНКП и стабилизацию транскрипционных комплексов. Мы показали, что мутации взаимодействующих с ДНК консервативных аминокислотных остатков в участке switch2: (1) нарушают плавление ДНК в районе старта транскрипции и уменьшают стабильность промоторных комплексов; (2) нарушают связывание инициаторных NTP в активном центре РНКП; (3) уменьшают эффективность ухода РНКП с промотора; (4) снижают стабильность элонгационных комплексов. Эти дефекты могут быть объяснены нарушением контактов РНКП с передним дуплексом ДНК. Таким образом, контакты района switch2 с ДНК обеспечивают стабильность транскрипционных комплексов на разных стадиях синтеза РНК и необходимы для эффективного связывания нуклеитидных субстратов в ходе инициации.

Второй исследованный район (F-петля) находится рядом с активным центром РНКП и контактирует с двумя участками, играющими ключевую роль в присоединении NTP в ходе катализа – F-спиралью и G-петлей -субъединицы. Мы показали, что мутации в районе F-петли приводят к значительным изменениям в скорости синтеза РНК. Полученные данные позволяют предположить, что F-петля необходима для формирования «закрытой» конформации активного центра в ходе присоединения NTP, которая образуется в результате конформационных перестроек G-петли и F-спирали. Таким образом, участок F-петли аллостерически влияет на скорость катализа в активном центре РНКП и может служить мишенью для действия различных регуляторных факторов.

Исследование древних штаммов бактерий, устойчивых к различным антибиотикам, показало, что многие из них характеризуются множественной лекарственной устойчивостью, которая обеспечивается: (1) мобильными элементами (плазмидами, транспозонами, интегронами), несущими сцепленные гены устойчивости к различным антибиотикам; (2) хромосомными генами устойчивости, вероятно, кодирующими различные efflux системы. Поскольку оба указанных механизма широко распространены среди современных множественно устойчивых бактерий, полученные данные свидетельствуют об их древнем происхождении.

При изучении древнего штамма Psychrobacter psychrophilus, характеризующегося двойной устойчивостью к стрептомицину и тетрациклину, рядом с генами устойчивости, имеющими плазмидную локализацию, выявили новый мобильный элемент, ISPps1, принадлежащий к семейству IS3. Продемонстрировано участие ISPps1 в перемещении генов устойчивости в различные плазмиды-мишени как в клетках P. psychrophilus, так и в клетках E. coli. Выявлено два способа перемещения генов устойчивости при посредстве ISPps1: путем одноконцевой транспозиции и путем формирования de novo сложных транспозонов, содержащих дополнительную копию ISPps1 на другом конце генов устойчивости. Гены устойчивости к стрептомицину и тетрациклину идентифицированы как strA-strB and tetR-tet(H), соответственно. Показано их близкое родство с соответствующими генами современных бактерий. Таким образом, эти гены присутствовали в природных популяциях бактерий задолго до начала использования антибиотиков в клинической практике.
Публикации Лаборатории молекулярной генетики

микроорганизмов ОМГК:
1. Barinova N., Kuznedelov K., Severinov K., Kulbachinskiy A. Structural modules of RNA polymerase required for transcription from promoters containing downstream basal promoter element GGGA. J. Biol. Chem, 2008, 283, 22482-22489.

2. Barinova N., Zhilina E., Bass I., Nikiforov V., Kulbachinskiy A. Lineage-specific amino acid substitutions in region 2 of the RNA polymerase  subunit affect the temperature of promoter opening. J. Bacteriol., 2008, 190, 3088-3092.

3. Петрова М.А., Горленко Ж.М., Соина В.С., Миндлин С.З. Изучение ассоциации генов strA-strB с плазмидами у современных и древних штаммов бактерий. Генетика, 2008, 44, 1281-1286.

4. Миндлин С.З., Соина В.С., Петрова М.А. Горденко Ж.М. Выделение устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий из многолетнемерзлых отложений Восточной Сибири. Генетика, 2008, 44, 36-44.

5. Пупов Д.В., Баринова Н.А., Кульбачинский А.В. Анализ РНК-расщепляющей активности РНК-полимераз E. coli и D. radiodurans. Биохимия, 2008, 73, 903-908.

<< предыдущая страница   следующая страница >>