microbik.ru
  1 ... 4 5 6 7 8 ... 10 11
^

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА


ЦМВ-ИНФЕКЦИИ

Широкая распространенность вируса, отсутствие типичных симптомов ЦМВ-инфекции, необходимость применения своевременной антивирусной терапии указывают на важность точной и быстрой диагностики как для предупреждения, так и для лечения цитомегалии.

Лабораторная диагностика ЦМВ - инфекции включает несколько подходов:

і) выявление инфекционных вирусных частиц;

2) обнаружение вирусных белков (антигенов);

3) определение вирусных нуклеиновых кислот;

4) характеристику специфического иммунного ответа;

5) оценку цитопатического действия на клетки больных.
^

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТЬІ


Специфические антитела к ЦМВ (анти-ЦМВ), присутствующие в сыворотках пациентов, могут быть определены различными методами.

Реакция связывания комплемента

и реакция нейтрализации.


Более двух десятилетий для выявления анти - ЦМВ в сыворотках больных и инфицированных ЦМВ лиц использовались реакция связывания комплемента (РСК) и реакция нейтрализации вирусной активности (РН). Обе реакции, обладая высокой специфичностью, имеют ряд недостатков. Так, РСК имеет низкую чувствительность и, кроме того способна выявлять специфические АТ на более поздних сроках течения инфекции по сравнению с другими разработанными методами. Это объясняет крайне редкое применения РСК для детекции иммунного ответа. Использование реакции нейтрализации также имеет ограниченное применение из-за невысокой чувствительности и наличия клинических изолятов, различающихся по антигенным свойствам. Однако, показано, что вируснейтрализующие антитела влияют на развитие инфекции. Установлено также, что протективные свойства АТ матери могут определять течение цитомегалии у новорожденных при вертикальной передаче.

Твёрдофазный ИФА.

В настоящее время разработан и широко используется для определения специфических АТ метод твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА). С помощью коммерческих тест-систем возможно определение анти-ЦМВ классов IgG и IgM. В качестве антигена используются очищенные вирусные частицы, лизат инфицированных клеток, а также рекомбинантные белки и синтетические пептиды.

В настоящее время достоверно установлено, что значительная часть населения имеет антитела к ЦМВ. Это означает, что выявление анти-ЦМВ не может быть единственным критерием при постановке диагноза. Кроме того, определяемый титр АТ часто не согласуется с клиническими проявлениями инфекции: высокие показатели АТ обнаруживаются как у здоровых носителей, так и у пациентов в период острой инфекции. На основании выявления антител класса М и G часто невозможно дифференцировать первичную и вторичную инфекции, острую и хроническую стадии заболевания. Показано, что тест на IgM может давать ложноотрицательный результат у новорожденных и у больных с синдромом иммунодефицита, а в случае реактивации латентного ЦМВ АТ класса М и G могут не выявляться. Иммуноглобулины класса IgM и IgG также обнаруживаются в сыворотках больных при первичной и вторичной инфекции, у пациентов с симптомами цитомегалии и у серопозитивных здоровых индивидуумов. К тому же, повышенные титры специфических иммуноглобулинов часто обнаруживают только при наличии выраженных клинических симптомов, что осложняет проведение своевременной антивирусной терапии.

Несогласованность между параметрами иммунного ответа и клиническими проявлениями, вероятно, связана с особенностями иммунного ответа при цитомегалии, часто возникающего на фоне иммунодефицитного состояния пациента. Поэтому определение вирусных антигенов и вирусных частиц становится важным подходом в диагностике ЦМВ-инфекции.

^ КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.

Выделение вируса.

Одним из традиционных методов лабораторной диагностики цитомегалии, который до сих пор называют “золотым стандартом”, является выделение вируса. ЦМВ может бить изолирован из различных биологических жидкостей, например, таких как кровь, материнское молоко, моча, выделения цервикального канала, слюна и спиномозговая жидкость, а также из биопсийного материала. Сокультивирование клинических образцов и пермиссивных к ЦМВ фибробластов приводит к цитопатическому действию (ЦПД) при наличии инфекционных вирусных частиц в исследуемом материале.

Период времени, необходимый для появления морфологических изменений в клетках, зависит от количества вибрионов в материале от больных и может варьировать от нескольких дней до нескольких недель и в среднем составляет 2 - 4 недели. ЦПД вируса достаточно характерно для постановки диагноза, но цитотоксичность некоторых образцов (моча, слюна и др.), а также слабая выраженность специфических, морфологических изменений клеток при сопутствующих инфекциях ограничивают применение этого метода диагностики.
Быстрый культуральный метод с использованием

моноклональных АТ.

Использование специфических моноклональных антител (МКА), направленных к белкам ЦМВ, позволяет определять наличие вирусного антигена в клетках до проявлений цитомегалических изменений. Применение МКА к сверхранним и ранним вирусным белкам в реакциях иммунофлюоресценции или пероксидазного окрашивания позволяет определить вирусный антиген уже через 16-48 часов после инфицирования культуры.

^ Сравнительный анализ культуральных методов.

Сравнительный анализ двух культуральных методов (выделение вируса и определение специфических АГ в клеточной культуре) показал, что окрашивание инфицированных клеток МКА является не только более быстрым, но и более специфичным и чувствительным методом определения инфекционных вирусных частиц в биологическом материале. Оценка чувствительности культурального метода с применением МКА при исследовании виремии у пациентов после трансплантации органов показала, что виремия определяется этим методом даже при дозе 0,02 инфекционные единицы на 100000 лейкоцитов.

Вследствие высокой чувствительности и специфичности указанный метод детекции цитомегалии приобрел широкое распространение в клинической вирусологии экономически развитых стран.

^ НЕПОСРЕДСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦМВ В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ

Морфологический анализ.

ЦМВ - инфицированные клетки в организме человека характеризуются определенными морфологическими изменениями, включающими: округление клеток, увеличение их размеров, появление многоядерных клеток и специфических внутриядерных включений. Эти изменения можно наблюдать в биопсийных материалах, в препаратах клеток, которые содержатся в биологических жидкостях (моче, молоке, слюне и др.) при окраске препаратов по методу Романовского-Гимза. Типичные цитомегалические клетки называют "совиным глазом" за характерные изменения ядер, связанные с резкой конденсацией хроматина.

Однако, этот метод не способен выявить все случаи ЦМВ- инфекции, так как вирує может инфицировать ткани и без проявления характерного ЦПД.

^ Иммуногистохимический и иммуноцитохимический

методы.

Разработанная техника иммуной гистохимии (ИГХ) и иммуной цитохимии (ИЦХ) с использованием МКА позволила преодолеть вышеуказанное ограничение. МКА к ІЕ,Е и L белкам, используются для выявления АГ в тканях и клетках пациентов. Проведенные исследования показали, что МКА, направленные к IЕ белкам, определяют вирусный АГ в морфологически неизмененных клетках; МКА к Е белкам преимущественно в цитомегалических клетках, в некоторых из которых присутствуют внутриядерные включения; МКА к Е антигенам только в клетках с выраженными цитопатическими изменениями. Таким образом, наибольшее число АГ-положительных клеток выявляется при окрашивании АТ к сверхранним белкам. Анализ динамики выявления клеток, синтезирующих белки ЦМВ, показал, что по числу окрашенных клеток и характеру окраски можно судить о течении инфекции и оценивать эффективность противовирусной терапии.

Метод полимеразной цепной реакции.

Наиболее чувствительный метод определения вирусной ДНК- это полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР широко используется в клинической вирусологии для скрининга и мониторинга цитомегалии. В экономически развитых странах ПЦР успешно применяют для детекции ЦМВ в различных биологических жидкостях, в биопсийном материале, в том числе в тканях, фиксированных формалином. Этот анализ эффективен и превышает по чувствительности все имеющиеся диагностические подходыі. Оценка чувствительности этого метода показала, что реакция ПЦР определяет 1 вирусный геном на 40 000 клеток, что составляет 0,01 пг ДНК, и в среднем в 100 раз чувствительнее изолирования вируса.

В настоящее время важно отметить два основных недостатка ПЦР как диагностического теста. Во-первых, это - низкая прогностическая ценность, связанная с тем, что ПЦР определяет ДНК вируса находящегося в латентном состоянии. Следовательно, часто ставится под сомнение положительный результат анализа. По данным разных исследователей, только у ограниченного числа пациентов (40°/іі-60 %), у которых выявлена ДНК ЦМВ методом ПЦР, разовьется цитомегалия. Видимо, только отрицательный результат ПЦР имеет 100 % диагностическое значение. Для увеличения диагностической и прогностической ценности разрабатываются количественные методы ПЦР, гнездовая и двойная технология анализа, проводится подбор праймеров как к сверхранним, ранним, так и к поздним генам. Вторым недостатком метода является его недостаточная пока специфичность, которая проявляется в значительных расхождениях результатов, полученных в разных лабораториях с одним и тем же материалом.

Таким образом, проблема специфичности лабораторной диагностики ЦМВ методом ПЦР сохраняется.

ПЦР с использованием РНК - зависимой полимеразы.

В настоящее время разрабатывается и апробируется технология ПЦР с применением РНК- зависимой ДНК- полимеразы. Значение этого метода определяется тем, что он позволяет выявлять мРНК реплицирующегося вируса. Этот метод по сравнению с ПЦР проигрывает в чувствительности, но его специфичность выше. При этом сохраняются проблемы, связанные с контаминацией, подбором праймеров, наличием ингибиторов полимеразной цепной реакции.

Подводя итог изложенному выше, можно констатировать, что существуют многочисленные методы и подходы в лабораторной диагностике цитомегалии. Выбор оптимального метода часто зависит от качества и источника собранных клинических образцов, индивидуальных особенностей обследуемых пациентов и стадии течения инфекции. Методом, сочетающем в себе 100 % специфичность и высокую чувствительность, является обнаружение вирусного АГ с помощью МКА в пермиссивных к ЦМВ клетках сокультивируемых с клиническим материалом.


<< предыдущая страница   следующая страница >>