microbik.ru
1 2 3
Автор Галина Николаевна Кокуева

Обнаружение биологически активных веществ
в продуктах питания


Из 109 известных в настоящее время химических элементов в живых организмах найдено более 70, из них около 20 встречается во всех типах организмов; как и в верхних слоях земной коры, в них количественно преобладают элементы с малыми атомными массами.
Таблица 1. Средний элементарный состав растений и животных (В.И.Вернадский)

Номера декад

Примерное содержание в биосфере, % на сырую массу

Элементы

Макроэлементы

I

10

O,H

II

1

C

III

0,1

N, P, K, Ca, Si

IV

0,01

Mg, S, Fe, Na, Cl, Al

Микроэлементы

V-VII

0,001- 10 -5

Mn, B, Cu, Zn, Ba, Li, Ni, Rb, F и др.

Ультрамикроэлементы

VIII-XIV

10-6 - 10-12

Mo, I, As, Ag, Hg, Au, Pb, Ra и др.


Существует определенная зависимость между распространением элементов в биосфере, их биологической ролью и положением в периодической системе Менделеева. Вещества живых организмов более чем на 99% состоят из элементов первых трех периодов этой системы, т.е. из легких элементов. Как правило, при переходе от легких к тяжелым элементам в пределах одной и той же подгруппы (например, Zn → Cd → Hg) возрастает токсичность элементов и одновременно уменьшается их содержание в биомассе. Высокой биологической активностью обладают многие соединения переходных металлов, главным образом 4 периода (с 21 по 30). Это связано с хорошо выраженной у этих элементов способностью к образованию комплексных соединений, в которых они играют роль центральных атомов. Комплексные соединения часто обладают каталитической активностью, входят в состав ферментативных молекул (например, железосодержащие гуминовые ферменты). Элементы некоторых подгрупп периодической системы могут в той или иной степени заменять друг друга в биологических процессах (например, Ca и Ba, Cl и Br).

Около 98% массы биосферы составляют четыре элемента: водород, кислород, углерод и азот. Они легко спаривают электроны и образуют прочные ковалентные связи. Малые размеры атомов этих элементов также способствуют образованию коротких, прочных химических связей. Молекулы с такими связями более устойчивы к действию химических и других факторов. Большое значение имеет также способность перечисленных элементов образовывать кратные связи (двойные, тройные), благодаря чему они превосходят многие элементы по числу и разнообразию соединений с уникальными свойствами.
Основными типами соединений, входящих в состав живых организмов, являются: белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды (жиры и жироподобные вещества), вода минеральные соли. Кроме них, в составе организмов присутствуют некоторые другие органические вещества: карбоновые кислоты, углеводороды, амины, спирты, альдегиды, дубильные вещества. И, наконец, в отдельные группы должны быть выделены вещества, присутствующие в тканях живых организмов, как правило, в небольших количествах, но играющие первостепенную роль в регуляции всего обмена веществ: гормоны, ферменты, витамины, антибиотики, фитонциды и т.п. Их иногда объединяют в группу биологически активных соединений.
Качественные реакции на белки
Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по аминокислотным радикалам ее. Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция. Примером реакций второго типа являются многочисленные цветные реакции на радикалы аминокислот (реакция Сакагучи — с α-нафтолом, реакция Паули - с нитритом калия, реакция Циммермана — с о-фталевым диальдегидом, нингидриновая реакция и др.)
Биуретовая реакция.

К 1-2 мл раствора белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия и хорошо перемешивают. Затем из капельницы добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди и снова хорошо перемешивают. Развивается интенсивное красно - фиолетовое окрашивание, свидетельствующее о наличии пептидных, т.е. -СО-NH-, связей в молекуле белка. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.

Для сравнения проводят ту же реакцию с биуретом, который легко может быть получен при нагревании мочевины:
2 H2N-CO-NH2 → +t → NH3 + H2N-CO-NH-CO-NH2

мочевина биурет
Для этого несколько кристаллов мочевины помещают в пробирку и осторожно прокаливают в пламени газовой горелки. По охлаждении приливают в пробирку 10%-ный раствор гидроксида натрия и добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди. После перемешивания развивается сине-фиолетовая окраска.

И в том, и в другом случае окраска вызвана образованием комплексного соединения:


Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:



Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп.

Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами полипептида.

Комплексы такого типа обладают преимущественно красной окраской (максимум поглощения в пределах 520-530 нм). В случае образования медных комплексов при участии трех или двух атомов азота окраска их преимущественно фиолетовая и синяя (с максимумами поглощения в пределах 540-580 нм и 615-670 нм соответственно). Поэтому окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой.
Нингидриновая реакция

К 1-2 мл разбавленного раствора белка приливают 3-4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при 70°С на несколько минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

Эта реакция обнаруживает в растворе α-аминокислоты. Сначала в результате взаимодействия аминокислоты с нингидрином возникает Шиффово основание. Затем оно претерпевает перегруппировку, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден.



Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина, и образовавшееся соединение, енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый Руэмана», по имени исследователя, впервые в 1910 г. изучившего эту реакцию.
Ксантопротеиновая реакция.

К 1 мл раствора белка добавляют 5-6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к раствору, имеющему кислую реакцию, не взбалтывая, по каплям избыток концентрированного раствора аммиака или щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

Ксантопротеиновая реакция происходит только при наличии в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). Желатина, например, не содержит ароматических аминокислот и поэтому она не дает ксантопротеиновой реакции. В результате реакции нитрования по радикалам ароматических аминокислот образуются желтоокрашенные нитросоединения. Изменение желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлено появлением хромофорной группы.

Реакция Сакагучи.

Берут в пробирку 2-3 мл разбавленного раствора белка, добавляют 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и вслед за этим несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромида натрия и вновь перемешивают. Развивается оранжево-красное окрашивание. Появление окраски объясняется взаимодействием α-нафтола в присутствии окислителя с гуанидиновыми группировками радикалов аргинина, имеющимся в молекуле белка.
Нитропруссидная реакция.

К 3 мл разбавленного белка приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония 2-3 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают несколькими каплями крепкого раствора аммиака. Если в белке присутствует цистеин, то происходит реакция, в результате которой развивается пурпурное окрашивание.
Реакция Паули.

К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 0,5%-ном растворе соляной кислоты приливают 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание.

Возникновение окраски обусловлено наличием в белковой молекуле остатков гистидина и тирозина.
Качественные реакции на углеводы.
Реакция Подобедова-Молиша с α-нафтолом.
Чувствительной реакцией на углеводы является реакция с α-нафтолом. Испытуемое вещество в твердом виде или в растворе должно быть свободно от волокон фильтровальной бумаги.

В пробирку берут 1 мл испытуемого раствора или крупинку твердого вещества, растворенного в 1 мл воды. Добавляют 2 капли 10%-ного спиртового раствора α-нафтола и по стенке пробирки приливают осторожно, без встряхивания, 2 мл концентрированной серной кислоты. Серная кислота опускается на дно пробирки, и на границе двух жидкостей образуется кольцо красно-фиолетового цвета. Фурфурол и 5-оксиметилфурфурол, образующиеся из углеводов под действием серной кислоты, конденсируясь с 2 моль сульфированного α-нафтола, дают триарилметановый хромоген, который окисляется серной кислотой в окрашенное хиноидное соединение.
Нафторезорциновая проба Толленса.
К 5-6 мл испытуемого раствора прибавляют 1 мл 1%-ного спиртового раствора нафторезорцина и такой же объем концентрированной соляной кислоты. Смесь осторожно нагревают до кипения и кипятят 1 мин. Затем охлаждают и взбалтывают с эфиром или бензолом.

Эфирный (бензольный) слой окрашивается в различные цвета: глюкоза, манноза, галактоза дают сине-зеленую окраску; рамноза – фиолетовую; арабиноза и ксилоза – темно-синюю; уроновые кислоты, для обнаружения которых часто применяется эта реакция, окрашивает эфирный слой в фиолетовый цвет.
Пробы на редуцирующие (восстанавливающие) сахара.
Реакция Троммера
Моносахариды в щелочной среде восстанавливают гидроксид меди (II) до гидроксида меди(I), окисляясь при этом до альдоновых кислот.

В пробирку наливают 1-2 мл раствора глюкозы и равный объем 10%-ного раствора гидроксида натрия. К смеси прибавляют при встряхивании по каплям 5%-ный раствор сульфата меди(II) до появления неисчезающей мути. Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки. Появляется желтое окрашивание (гидроксид меди(I)), переходящее в оранжево-красное (оксид меди (I)), что указывает на положительную реакцию Троммера.

Реакция с фелинговой жидкостью.

Фелингова жидкость содержит ион меди(2+) в виде комплекного соединения с тартратами. Механизм реакции редуцирующих углеводов с фелинговой жидкостью такой же, как и реакции Троммера. Преимуществом фелинговой жидкости является то, что медь при избытке реактива не выпадает в виде оксида меди(II).

К 1-2 мл раствора глюкозы приливают равный объем фелинговой жидкости и смесь нагревают до начинающегося кипения. Образуется красный осадок оксида меди(I).

Приготовление Фелинговой жидкости:

Готовят два раствора. А — 34,6 г медного мупороса в 500 мл раствора; И - 173 г сегнетовой соли и 70 г гидроксида натрия в 500 мл раствора. Растворы хранят раздельно. Перед употреблением смешивают равные объемы первого и второго раствора.
Реакция Селиванова на кетозы.

При нагревании фруктозы (и других кетогексоз) с соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол, который с резорцином образует соединение, окрашенное в вишнево-красный цвет.

Альдозы также дают эту реакцию, но реакция у них протекает медленнее и в особых условиях (температура и кислотность среды).

В две пробирки наливают по 3 мл реактива Селиванова (0,05 г резорцина растворяют в 100 мл разбавленной (1:1) соляной кислоты), в одну из них добавляют 3 капли раствора фруктозы, в другую - 3 капли раствора глюкозы. Обе пробирки помещают в водяную баню, нагретую до 80ºС, и держат в ней 8 минут. За это время в пробирке с фруктозой появляется красное окрашивание.
Реакция Барфеда (отличие восстанавливающих дисахаридов от моносахаридов)

Проба Барфеда отличается тем, что окисление сахара протекает не в щелочной среде, а в среде, близкой к нейтральной. В этих условиях редуцирующие дисахариды в противоположность моносахаридам практически не окисляются, что позволяет отличить их от моносахаридов.

К 5 мл раствора Барфеда прибавляют 1 мл раствора исследуемого сахара. Смесь нагревают на водяной бане в течение 10 мин. Моносахариды восстанавливают реактив до оксида меди(I), дисахариды реакции не дают. Следует избегать длительного кипячения, так как дисахариды в кислой среде могут гидролизоваться до моносахаридов, и в результате реакция Барфеда станет положительной.

Приготовление реактива Барфеда.

13, 3 г ацетата меди растворяют в 200 мл горячей воды. Фильтруют и к фильтрату прибавляют 1,9 мл ледяной уксусной кислоты
Реакция крахмала и гликогена с иодом

К 2-3 мл раствора крахмала прибавляют 1-2 капли раствора Люголя. Раствор окрашивается в синий цвет. Содержимок пробирки делят на три части: к первой прибавляют 1-2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, ко второй — 2 мл этилового спирта; третью часть нагревают. Во всех случаях окраска исчезает, причем в третьей пробе окраска вновь появляется при охлаждении. Реакция основана на образовании нестойкого адсорбционного соединения иода с амилозой.

В пробирку наливают 2-3 мл раствора гликогена, добавляют 1-2 капли раствора Люголя, перемешивают, появляется красно-бурое окрашивание. Окраска усиливается при добавлении нескольких кристаллов хлорида натрия, но исчезает при добавлении раствора гидроксида натрия при нагревании.

Раствор Люголя готовят растворением 1 г иода и 2,5 г иодида калия в 20 мл воды. по растворении объем раствора доводят до 100 мл.
Микрохимическое определение сахаров путем окисления периодатом.

Аналитическая ценность иодной кислоты заключается в том, что она окисляет все вторичные карбинольные группы в молекуле сахара до муравьиной кислоты, которая определяется титрованием, а первичные карбинольные группы — формальдегида, который может быть связан димедоном:

СНO-(СНОН)4-СН2ОН + IO4 -- → 5 HCOOH + H2CO + 5 IO3-

Пентозы и метилпентозы образуют по 4 моль муравьиной кислоты, гексозы — по 5 моль, фруктоза и сорбоза — по 3 моль.

В пробирку с пришлифованной пробкой помещают около 3 мг сахара и растворяют его в 5 мл воды. К полученному раствору добавляют 1мл 0,25 М раствора периодата натрия.Смесь нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения пробирки добавляют 0,2 мл этиленгликоля для разложения избытка периодата. Одновременно ставят контрольный опыт, в котором присутствуют все реагенты, кроме сахара. Раствор титруют 0,01 н раствором гидроксида натрия, применяя в качестве индикатора метиловый красный.

следующая страница >>