microbik.ru
1


Международный университет природы, общества и человека «Дубна»

Кафедра химии, геохимии и космохимии

Курсовая работа
по органической химии

на тему:

«Модификация поверхности наночастиц меркаптокислотами с различной длиной углеводородного радикала»

Выполнила:

студентка III курса группы 3171

Алампиева Елена Витальевна
Научный руководитель:

доцент, к.х.н. Вакштейн М.С.
Консультант:

профессор, д.х.н. Гладышев П.П.,


Дубна, 2008.

«Модификация поверхности наночастиц меркаптокислотами с различной длиной углеводородного радикала»

Алампиева Елена

3 курс, группа 3171

Кафедра химии, геохимии и космохимии

Международный университет природы, общества и человека «Дубна»

Аннотация.

Работа посвящена изучению влияния длины углеводородного радикала органических лигандов, закрепленных на поверхности наночастиц, на устойчивость золя данных частиц в водной среде. В работе был проведен анализ двух методик гидрофилизации поверхности квантовых точек – с использованием меркаптоундекановой и меркаптоуксусной кислот. Исследование показало, что длинноцепочечные меркаптокарбоновые кислоты обеспечивают большую стабильность наночастиц в водной среде.

Работа была выполнена в Центре Высоких Технологий ФГУП «Научно-исследовательский институт прикладной акустики» под руководством доцента, к.х.н. Вакштейна М.С. в 2008 году.

«Nanoparticles` surface modification: using mercaptoacids with different hydrocarbon radicals` length»

Alampieva Elena

3rd-year student, group 3171

Chair of Chemistry, Geochemistry and Cosmochemistry

State University of Nature, Society and Man «Dubna»

Abstract.

The work is devoted to the investigation of the influence of hydrocarbon «skeleton» length on the stability of colloidal particles in water phase. In the present paper we have undertaken a comparative analysis of two methods of conversion of quantum dots into water – with the usage of mercaptoundecanoic and mercaptoacetic acids. On the basis of the fulfilled investigation it is possible to make a conclusion about the advantages of mercaptoundecanoic acid over mercaptoacetic acid.

The work was performed at the Center of High Technologies of Research Institute of Applied Acoustics under scientific supervision of the Head of the Nanocomposite materials laboratory, PhD in Chemistry M.S. Wakstein in 2008.
Содержание


  1. Введение 4

  2. Литературный обзор 5

  3. Экспериментальная часть 17

  4. Обсуждение результатов 20

  5. Выводы 24

  6. Список литературы 25

Введение

В настоящее время все большее значение приобретает использование квантовых точек в биологии и медицине. Однако синтезируемые нанокристаллы покрыты слоем гидрофобных лигандов и растворимы только в органических растворителях (хлороформ, толуол, гептан и т.п.). Их использование в биологических средах требует изменения свойств поверхности, формирования на поверхности частиц гидрофильных групп, через которые к ним могли бы далее присоединяться биологические молекулы.

В литературе описано достаточно много методов гидрофилизации поверхности КТ. Во всех этих методах реализуется 3 основных подхода:

  1. Обмен гидрофобных лигандов на гидрофильные.

  2. Образование вторичной органической оболочки за счет гидрофобных взаимодействий.

  3. Заключение нанокристаллов в полимерную оболочку.

В данной работе был выбран метод гидрофилизации коллоидных КТ с использованием меркаптокислот - один из наиболее простых и легкоосуществимых. Он основан на обмене гидрофобных лигандов, которые находятся на поверхности КТ, на гидрофильные меркаптокислоты. При этом сера соединяется с поверхностью КТ, а гидрофильная карбонильная группа, находящаяся на поверхности КТ, обеспечивает растворимость нанокристаллов в воде.

Далее диспергированные в воду КТ через карбоксильные группы на поверхности «сшиваются» с молекулой белка и могут использоваться в качестве сенсоров и в иммунологических диагностических системах.

Литературный обзор

Квантовые точки – что это?

Квантовые точки (КТ) – это кристаллы нанометрового размера, которые обладают особыми физико-химическими свойствами в отличие от объёмных кристаллов. Как правило, квантовые точки представляют собой полупроводниковые соединения элементов II-VI, III-V групп периодической системы, например CdSe, ZnS, HgTe, InP, GaAs.

Флуоресцирующие полупроводниковые нанокристаллы, квантовые точки, обладают уникальными оптическими и химическими характеристиками.

Для спектра поглощения КТ характерно наличие экситонного пика, который возникает за счет поглощения энергии при энергетических переходах внутри нанокристаллов.

Яркость свечения нанокристаллов оказывается настолько высокой, что они оказываются детектируемыми как единичные объекты с помощью рутинного флуоресцентного микроскопа. Квантовые точки разных размеров (диаметров) поглощают свет в широком диапазоне оптического спектра от УФ- до ближней ИК-области, тогда как их спектр испускания крайне узок (ширина спектра на полувысоте составляет 15—30 нм), идеально симметричен, а положение максимума испускания флуоресценции нанокристаллов определяется их диаметром [1].

Кроме того, квантовые точки являются очень фотостабильными, обеспечивая как возможность многократного увеличения мощности возбуждающего излучения, так и длительного (в течение дней или даже недель) отслеживания поведения метки в реальном времени.

Оптические свойства нанокристаллов

Оптические свойства полупроводниковых нанокристаллов определяются взаимодействием электронов и дырок с их локальным окружением. Квантовые точки поглощают фотоны, если их энергия больше ширины запрещенной зоны. В результате электроны переходят из валентной зоны в зону проводимости. По данным УФ-спектроскопии обнаружено наличие большого числа энергетических уровней квантовых точек. Самый низкий возбужденный уровень соответствует самому длинноволновому пику, называемому экситонным («excitonic» или «band gap» или «quantum-confinement peak»). Мультиплетные состояния находятся на более высоких энергетических уровнях, что обеспечивает возможность возбуждения квантовых точек излучением с более короткой длиной волны. Коэффициент молярной экстинкции нанокристаллов постепенно возрастает с уменьшением длины волны (рис. 1).


Рис. 1.Спектры поглощения и флуоресценции сферических CdSe/ZnS нанокристаллов структуры ядро/оболочка. Диаметр CdSe ядер: 2.5 нм (зеленые), 3.3 нм (желтые) и 4.8 нм (красные). На вставке: флуоресценция CdSe/ZnS нанокристаллов разных размеров. Для всех нанокристаллов использован один источник возбуждения ртутная лампа [2].
Эта особенность оказывается крайне важной для биологических приложений нанокристаллов, позволяя одновременно возбуждать квантовые точки разных цветов единственным источником возбуждения.

Флуоресценция нанокристаллов является результатом рекомбинации подвижных или связанных носителей заряда. Рекомбинация подвижных носителей дает флуоресценцию, называемую экситонной и имеющую острый пик. Спектр эмиссии единичного кристалла селенида кадмия, покрытого слоем ZnS, имеет ширину 13 нм (ширина на половине высоты) при комнатной температуре [1].

Варьируя размеры и состав полупроводниковых нанокристаллов, удается изменять длину волны их флуоресценции от синей до ИК-области оптического спектра (табл. 1).



Табл. 1. Спектральные свойства материалов квантовых точек [1].
В частности, нанокристаллы CdS и ZnSe флуоресцируют от УФ до синей области спектра. Нанокристаллы CdSe разных размеров светятся практически во всем видимом диапазоне, а нанокристаллы состава InP или InAs флуоресцируют в далеком красном и ИК диапазонах. Следует также отметить, что вытянутые квантовые точки (квантовые стержни) дают линейно поляризованное излучение, в то время как флуоресценция сферических CdSe нанокристаллов неполяризована или поляризована по кругу [1].

По сравнению с такими органическими красителями, как родамин 6Ж или флуоресцеин, нанокристаллы из селенида кадмия демонстрируют такой же или несколько меньший квантовый выход при комнатной температуре. Однако этот более низкий квантовый выход компенсируется их более высоким сечением поглощения и существенно меньшим фототушением флуоресценции. Бавенди с соавт. [6, 7] определили, что коэффициент молярной экстинкции CdSe нанокристаллов составляет примерно 105—106 М-1•см-1 и зависит от размера частиц (рис. 2) и длины волны возбуждения (рис. 1).



Рис. 2. Зависимость положения пика эмиссии флуоресценции CdSe/ZnS нанокристаллов коэффициента экстинкции (в длинно-волновом экситонном максимуме поглощения) от диаметра CdSe ядра нанокристалла [2].
Это значение существенно больше, чем у органических красителей. Таким образом, свечение единичного нанокристалла из CdSe, покрытого оболочкой ZnS, оказывается примерно в 20 раз ярче, чем свечение органических красителей, причем фотостабильность нанокристаллов оказывается в 100—3000 раз выше, чем стабильность органических флуорофоров [1].

Применение квантовых точек

Перечисленные свойства квантовых точек могут сделать их идеальными флуорофорами в системах сверхчувствительной детекции и диагностики различных заболеваний, требующих параллельной регистрации многих параметров одновременно с целью установления точного диагноза.

Сконъюгированные с биологическими молекулами наночастицы могут использоваться при гибридизации ДНК, в иммунологических диагностических системах и при рецепторном эндоцитозе, а также во флуоресцентных методах селективной визуализации биологических объектов (клеток, тканей и вирусов).
Яркость и фотостабильность нанокристаллов позволяет регистрировать и наблюдать молекулярные движения, обусловленные действием моторных белков в реальном времени с временным разрешением 300 мкс и пространственным разрешением до 1.5 нм [1]. Нанокристаллы являются также потенциально новым классом флуоресцентных меток при получении изображений живых клеток. Особенно важным оказался факт исключительно высокой фотостабильности нанокристаллов, позволяющий использовать их в конфокальной микроскопии при получении пространственного распределения биологических рецепторов, или отслеживать внутриклеточные процессы в реальном времени в течение долгого периода (часы и даже дни).
Другим достоинством нанокристаллов является использование многих цветов для одновременного мечения многих мишеней внутри клеток или на их поверхностях. Более того, будучи покрытыми инертным органическим слоем, нанокристаллы даже менее токсичны, чем органические красители [1].

Многоканальное оптическое кодирование и высокопроизводительный анализ генов и белков с помощью микросфер с включенными в них нанокристаллами разных цветов открывают перспективы параллельной регистрации миллионов белков или последовательностей нуклеиновых кислот.

Методы нанотехнологии, применяемые в биотехнологии, позволяют надеяться на появление в самом ближайшем будущем диагностикумов нового поколения, основанных на полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллах и обеспечивающих рекордные чувствительности и быстроту параллельного анализа многих биологических параметров.

История квантовых точек

Уменьшение размера частиц вещества до десятка нанометров и ниже приводит к тому, что свойства вещества начинают определяться не только и не столько его химическим составом, сколько размером. Известно, что уменьшение размера частиц некоторых соединений до нескольких нанометров может изменять цвет, проводимость, механические и другие свойства вещества. Нанометровый диапазон размеров открывает новые подходы к изучению свойств веществ, а возможность программируемой сборки наночастиц в микро- и макрообъекты (методы «bottom-up» — «снизу вверх») является абсолютно новой областью инженерного подхода к созданию малодефектных микроструктур и «микромашин», рассматриваемой как альтернатива традиционному для человечества подходу «top down»— «сверху вниз» (начиная от изготовления каменного топора к методам микролитографии и т.д.). Именно поэтому достижения нанотехнологии названы в США предвестником новой промышленной революции 21 века и одним из основных приоритетов в европейском сообществе.

В 1993 г. Бавенди с соавт. [6] опубликовали метод синтеза высококачественных гомогенных квантовых точек из селенида кадмия, которые могли быть представлены в виде дисперсии наночастиц в органических растворителях и чья поверхность могла быть сделана полярной методами химии поверхности. Эти квантовые точки были слабофлуоресцирующими (квантовый выход 10%). Принципиальный прорыв в технологии последовал после покрытия полупроводникового CdSe ядра квантовой точки несколькими слоями сульфида цинка, что позволило повысить квантовый выход их флуоресценции до величин, сравнимых с органическими флуорофорами, а оптимизация технологии покрытия ядер квантовых точек оболочкой позволила получать нанокристаллы с квантовым выходом, превышающим 70% при комнатной температуре.

Синтез нанокристаллов

Методы синтеза нанокристаллов из элементов II—VI (CdSe, CdTe, CdS и ZnSe) и III-V (InP и InAs) групп разработаны довольно давно. Однако до 1993 г. нанокристаллы готовили в водных растворах в присутствии стабилизирующих агентов, таких как тиоглицерин или полифосфат. Такой метод давал на выходе низкокачественные нанокристаллы с низким выходом флуоресценции и большим разбросом по размерам (относительный разброс размеров превышал 15%).

В 1993 г. Бавенди с соавт. [6], используя высокотемпературный органометаллический синтез, синтезировали хорошо люминесцирующие квантовые точки из CdSe.

Типичная технология синтеза CdSe нанокристаллов заключается в следующем. Диметил кадмия и селеновую пудру, растворенную в триалкилфосфине (бутиле или октиле) впрыскивают в горячий (340—360°С) триоктилфосфин оксид (ТОФО) технической чистоты 90%) [1]. В результате при температуре 280—300°С формируются зародыши нанокристаллов. Молекулы растворителя адсорбируются и десорбируются с поверхности растущих нанокристаллов, обеспечивая осаждение (или удаление) атомов кристалла. Агрегация подавляется постоянным присутствием на поверхности нанокристаллов монослоя атомов растворителя.

В связи с тем, что приготовленные методами органометаллического высокотемпературного синтеза квантовые точки являются гидрофобными, очередным необходимым этапом в их применении в биологических науках явилась разработка технологий их перевода в водную фазу, стабилизации и конъюгации с белками, пептидами и нуклеиновыми кислотами. Первой такой технологией стало заключение нанокристаллов в дополнительный кремниевый или силоксановый слой толщиной 1—5 нм, содержащий на своей поверхности тиольные, аминогруппы или карбоксильные группы, обработка поверхности меркаптокислотами, заключение их в фосфолипидные мицеллы либо заключение нанокристаллов в дополнительную органическую оболочку из би- или трифункциональных полимеров, способных связываться с поверхностью наночастиц, обеспечивать их растворимость в водной фазе за счет полярных групп и содержащих дополнительные функциональные группы, доступные для конъюгации [1].

Технология перевода нанокристаллов в водную фазу.

Синтезируемые CdSe/ZnS нанокристаллы покрыты слоем ТОФО (и другими лигандами) и растворимы только в органических растворителях (хлороформ, толуол, гептан и т.п.). Их использование в биологических средах требует изменения свойств поверхности, формирования на поверхности частиц гидрофильных групп, часть из которых могла бы далее быть спейсером для присоединения к ним биологических молекул. К настоящему времени опубликовано много работ, посвященных методам солюбилизации нанокристаллов. По существу, во всех этих работах реализуются три основных подхода: (1) использование бифункциональных соединений, способных замещать молекулы ТОФО и содержащие гидрофильные группы, которые после присоединения к нанокристаллам оказываются экспонированными в раствор и обеспечивают водорастворимость; (2) формирование полимерного слоя вокруг нанокристалла за счет проникновения гидрофобных фрагментов солюбилизирующих агентов в оболочку ТОФО без удаления молекул ТОФО с поверхности нанокристаллов и (3) внедрение полупроводниковых нанокристаллов в полимерные микрочастицы (микросферы или микрокапсулы).
Перевод нанокристаллов в водную фазу методом замещения ТОФО бифункциональным лигандами.

Метод основан на непосредственной адсорбции бифункциональных лигандов, способных связываться с поверхностными атомами цинка или серы через тиольные или фосфиновые группы таких соединений, как меркаптокислоты, цистеин и т. п., а также через SH-группы, введенные методом химической модификации в молекулы этиленгликоля, ДНК, белков или пептидов [1]. Раствор лигандов добавляют к покрытым молекулами ТОФО нанокристаллам в хлороформе. Связывание атомов серы с поверхностными ионами цинка или серы приводит к замещению молекул ТОФО на солюбилизирующие лиганды. В результате нанокристаллы выпадают в осадок из органического растворителя, но становятся растворимыми в воде.

Недостатком описанного метода является динамический характер связи лиганда с поверхностью нанокристалла (связей S-S и/или Zn-S). Получаемые солюбилизированные наночастицы недостаточно стабильны, а в растворе всегда находится заметное количество несвязанного лиганда. Постепенный переход молекул лиганда в раствор приводит к осаждению нанокристаллов.

Методом повышения стабильности явилось использование двух-, трех- и более валентного (поливалентного) связывания лиганда с нанокристаллом [1]. Наиболее интересен метод, комбинирующий поливалентное связывание с последующим формированием полимерной оболочки вокруг CdSe/ZnS нанокристалла, предложенный Аливасатосом [4, 5]. На поверхности нанокристаллов формируют слой окиси кремния с силоксаном, далее силоксановые группы полимеризуют и ковалентно присоединяют к ним метокси-соединения (например, аминопропил триметоксисилан). Покрытые полимеризованным силоксаном нанокристаллы очень стабильны. Основной недостаток описанного метода заключается в сложности и продолжительности процедуры солюбилизации, больших потерях материала и малом выходе солюбилизированных нанокристаллов (единицы миллиграммов). Кроме того, квантовый выход флуоресценции нанокристаллов, солюбилизированных по этой методике, редко превышает 20%.

Кроме обеспечения водорастворимости и биосовместимости нанокристаллов, солюбилизирующие агенты выполняют также защитную функцию, предохраняя флуоресцентные метки от воздействия биологической среды в виде содержащихся в ней тушителей флуоресценции, ухудшающих оптические свойства нанокристаллов. К сожалению, синтезируемые новые лиганды часто специализированы под конкретную задачу, что ограничивает их общую применимость.
Пептидный синтез

Перспективным продолжением данной работы является «сшивание» белков с водорастворимыми квантовыми точками, т.е. пептидный синтез. Данное направление актуально для биологических применений квантовых точек (например, создания биомаркеров).

Образование пептидной связи в мягких условиях удается лишь при активировании карбоксильного компонента одной из аминокислот, вступающей в реакцию (рис.3). Вторая аминокислота Б (аминокомпонент) атакует активированный карбоксильный компонент аминогруппой с образованием пептидной связи. Незащищенная аминофункция карбоксильного компонента А тоже может реагировать, что приводит к нежелательным побочным продуктам — линейным и циклическим пептидам. Для однозначного протекания реакции следует временно блокировать все функциональные группы, не участвующие в образовании пептидной связи, т.е. проводить процесс многоступенчато.


Рис. 3. Основной принцип пептидного синтеза [2].
В первую очередь получают частично замещенные аминокислоты, при этом они одновременно теряют цвиттерионную структуру. Вторая ступень, собственно образование пептидной связи, протекает в две стадии. Сначала нужно активировать N-защищенный карбоксильный компонент. Затем происходит собственно образование пептидной связи, которое протекает либо одноступенчато (вместе с активированием), либо последовательно в следующую стадию. На третьей ступени защитные группы селективно отщепляются, причем полученные частично защищенные производные дипептидов могут использоваться для дальнейших синтезов как карбоксильные или аминокомпоненты. Само собой разумеется, что в случае синтеза дипептида обе защитные группы удаляются одновременно.

Образование пептидной связи можно рассматривать как нуклеофильную реакцию полярной двойной связи. Образование пептидной связи должно протекать в мягких условиях, поэтому необходимо активировать карбоксильную группу (Rj — остаток карбоксильного компонента). Повышение электрофильных потенциалов достигается введением электроаффинных -I или -М (индуктивных или мезомерных) заместителей (XR'), которые снижают электронную плотность как на карбонильном углероде, так и на карбонильном кислороде. Благодаря этому повышается чувствительность к нуклеофильному воздействию аминокомпонента (R2 — остаток аминокомпонента).


Схема 1. Образование пептидной связи [2].
Нуклеофильный аминокомпонент воздействует на углеродный атом карбоксила свободной парой электронов; при этом происходит перераспределение электронов с образованием промежуточного продукта, который, обладая повышенной реакционной способностью, расщепляется с выделением R'X-.

Лишь немногие методы синтеза пептидов имеют практическое значение. Это азидный метод, метод смешанных ангидридов карбоновых и алкилугольных кислот, метод активированных эфиров и, наконец, карбодиимидный метод (рис.4), который в своей модифицированной форме (карбодиимид с добавками) наиболее широко используется в синтезах.

К протонированному карбодиимиду присоединяется анион карбоксильного компонента с образованием ацилуреида I (О-ациллактим, производное изомочевины), который с аминокомпонентом образует пептид с отщеплением замещенной мочевины (путь а). Протежированная форма ацилизомочевины Iа может реагировать со следующей молекулой ациламинокислоты с образованием симметричного ангидрида III и N,N'-дизамещенной мочевины (путь в). Симметричный ангидрид может реагировать с аминокомпонентом, образуя пептид и одну молекулу ациламинокислоты (путь г).


Рис. 4. Механизм образования пептидной связи с помощью ДЦГК. R — циклогексил, R, — остаток N-защищенной аминокислоты или пептида, R2 — остаток С-защищенной аминокислоты или пептида [2].
Катализируемая основаниями перегруппировка О-ациллактима I в производное ацилмочевины (путь б) является нежелательной реакцией, так как приводит к неактивному соединению II. Эта реакция (О — N-миграция ацильной группы) катализируется не только избытком третичных оснований, катализ вызывается также аминокомпонентом и самим карбодиимидом, которые обладают достаточной основностью для этого.

Применение дициклогексилкарбодиимида

N,N'-дициклогексилкарбодиимид (R — циклогексил) особенно пригоден в качестве конденсирующего реагента в тех случаях, когда продукт хорошо растворим в растворителях, обычно применяемых для пептидных синтезов.

Образующаяся при проведении синтезов дициклогексилкарбодиимидным методом N,N'-дициклогексилмочевина выпадает из реакционной смеси. Дициклогексилкарбодиимидные сочетания можно проводить в присутствии воды, так как скорости гидролитического и аминолитического расщепления О-ациллактима заметно различаются.

ДЦГК-метод особенно пригоден при ступенчатом синтезе пептидных фрагментов. Этим методом можно соединять без рацемизации пептидные фрагменты, имеющие на С-конце пролин или глицин. Во всех других случаях существует опасность рацемизации. Другим недостатком является уже упоминавшееся образование ацилмочевины. Этой побочной реакции можно в какой-то степени избежать, поддерживая низкую температуру и применяя неполярные растворители. Применение в качестве растворителей диметилформамида и N,N'-диметилацетамида приводит к образованию производных ацилмочевины. Эти растворители даже при высокой степени чистоты содержат небольшие количества диметиламина, способствующего О→N-миграции ацильной группы. Далее, ДЦГК-активирование незащищенных остатков аспарагина и глутамина приводит к соответствующим нитрилам вследствие дегидратации амидных групп. Поэтому целесообразно при конденсациях с карбодиимидом использовать производные аминокислот, полностью защищенные по боковым функциям.

Экспериментальная часть

Введение

Целью данной курсовой работы является изучение влияния длины УВ скелета кислоты на устойчивость коллоидных частиц в водной фазе.

Для применения КТ в биологии и медицине необходимо создать гидрофильную оболочку на поверхности наночастиц. Нами для изучения был выбран способ модификации поверхности с помощью меркаптокислот.

В данной работе использовался метод гидрофилизации коллоидных КТ с использованием меркаптокислот - один из наиболее простых и легкоосуществимых. Он основан на обмене гидрофобных лигандов, которые находятся на поверхности КТ, на гидрофильные меркаптокислоты. При этом сера соединяется с поверхностью КТ, а гидрофильная карбонильная группа, находящаяся на поверхности КТ, обеспечивает устойчивость коллоидной системы в воде.

В раствор коллоидных КТ в органическом растворителе добавляется меркаптокислота либо раствор кислоты, после чего эта смесь перемешивается в течение определённого промежутка времени. Из исходного раствора КТ осаждаются центрифугированием и полученный осадок растворяют либо в воде с добавлением щелочи, либо в буферном растворе.

Известно, что высокая поверхностная активность коллоидных ПАВ очень сильно зависит от длины углеводородного радикала. Увеличение длины радикала на одну группу CH2 приводит к возрастанию поверхностной активности приблизительно в 3,2 раза (правило Дюкло-Траубе) [8].

При большой длине углеводородных радикалов, когда заметно проявляется взаимодействие между молекулами ПАВ на поверхности, поверхностная активность увеличивается медленнее, чем это следует из правила Дюкло-Траубе. И все же с увеличением длины углеводородного радикала поверхностная активность ПАВ повышается.

В нашем случае оба конца молекулы полярны, а их разделяет УВ радикал. Поэтому устойчивость лигандов на поверхности обусловлена гидрофобным взаимодействием данных радикалов между собой и созданием, так называемой органической «шубы» между полярными слоями HS- и COOH. Данная «шуба» в том числе экранирует нанокристалл от тушителей флуоресценции, присутствующих в воде.

Методики

В курсовой работе была использована методика, по переводу квантовых точек в воду, приведенная в статье [3].

1 мл квантовых точек диспергировали в растворе 200мг меркаптокислоты в 4 мл 1,4-диоксана (99%). Смесь перемешивали в течение 18 часов, после этого центрифугировали в течение 5 минут при 2000 об/мин, декантировали и промывали диоксаном 3 раза. После каждого промывания осадок центрифугировали при тех же условиях. После последнего центрифугирования слили супернатант и осадок растворили в 4 мл деионизированной воды + 0,5 мл 0,1 М раствора NaOH. Квантовые точки частично диспергировали. Конечный раствор еще раз центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин.

Позже методика была модифицирована. Уменьшили количество взятых КТ до 0,1 мл, вместо 4 мл деионизированной воды + 0,5 мл 0,1 М раствора NaOH использовали 4 мл 0,1М раствора NaOH, а полученный раствор перед заключительным центрифугированием подвергали воздействию ультразвука в течение 20 минут.

Сначала параллельно переводили в воду различные квантовые точки CdSe/ZnSe и CdS/ZnS. Для гидрофилизации использовали меркаптоундекановую кислоту. Была проведена серия параллельных экспериментов с различными образцами квантовых точек. Спектры флуоресценции показали, что перевод в воду лучше происходит для квантовых точек CdS/ZnS.

Затем квантовые точки CdS/ZnS переводили в воду, используя меркаптоуксусную кислоту. Применялась та же методика, только вместо 200 мг меркаптоундекановой кислоты добавляли по 0,06 мл меркаптоуксусной. Флуоресценция в полученных таким образом образцах была очень низкой, что косвенно указывает на плохую гидрофилизацию поверхности нанокристаллов.
Реактивы и оборудование

В настоящей работе использовались следующее реактивы:

  • КТ CdSe/ZnSe (положение максимума 583 нм, полуширина пика 27 нм, квантовый выход 35,9%)

  • КТ CdS/ZnS (положение максимума 481 нм, полуширина пика 21 нм, квантовый выход 13,6%)

  • КТ CdS/ZnS (положение максимума 471 нм, полуширина пика 19 нм, квантовый выход 8,6%)

  • Меркаптоундекановая кислота (Aldrich, 95%)

  • 1,4-диоксан (99%, Химмед)

  • Деионизированная вода Milli-Q (сопротивление 18 МОм)

  • Меркаптоуксусная кислота (Acros Organics, 98%)

  • Гидроксид натрия микрогранулы (Химмед, х.ч.)

В ходе эксперимента применялось оборудование:

  • Центрифуга MiniSpain (Eppendorf)

  • Центрифуга Allegra X-22 Centrifuge (Beckman Coulter)

  • Аналитические весы ExplorerPro (OHAUS)

Спектры поглощения и возбуждения снимались на:

  • Спектрофотометре Agilent 8453 (Agilent)

  • Спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian)

Обсуждение результатов

В ходе данной курсовой работы был проведен анализ методик перевода различных квантовых точек в воду. Были получены следующие результаты.

Из результатов экспериментов по гидрофилизации КТ CdSe/ZnSe в меркаптоуксусной кислоте, проведенных ранее в нашей лаборатории, мы можем наблюдать существенное снижение флуоресценции (рис. 5). Этот эффект может быть объяснен тем, что меркаптоуксусная кислота имеет короткий углеводородный скелет, поэтому «шуба», образованная данной кислотой, лишь в незначительной степени экранирует нанокристалл от тушителей флуоресценции, присутствующих в воде, например кислорода.



Рис. 5. Спектр флуоресценции КТ CdSe/ZnSe, модифицированных меркаптоуксусной кислотой.
Нами был проведен эксперимент по переводу в воду аналогичных КТ CdSe/ZnSe, но с использованием меркаптоундекановой кислоты. Как видно из рисунка 6, в данном случае падение флуоресценции незначительно.



Рис. 6. Спектр флуоресценции КТ CdSe/ZnSe, модифицированных меркаптоундекановой кислотой.
Вероятно, это происходит вследствие того, что меркаптоундекановая кислота за счет более длинного УВ-радикала намного лучше экранирует поверхность нанокристалла.

Затем аналогичная методика применялась для КТ CdS/ZnS в двух параллельных сериях. Можно заметить, что результаты также являются удовлетворительными.



Рис. 7. Спектр флуоресценции КТ CdS/ZnS (481 нм), модифицированных меркаптоундекановой кислотой.



Рис. 8. Спектр флуоресценции КТ CdS/ZnS (471 нм, модифицированных меркаптоундекановой кислотой.
Также возможно, что «шуба», создаваемая меркаптоундекановой кислотой, препятствует изменению поверхности и процессу автоокисления.

В заключение эксперимента было решено использовать для точек CdS/ZnS меркаптоуксусную кислоту:



Рис. 9. Спектр флуоресценции КТ CdS/ZnS (481 нм), модифицированных меркаптоуксусной кислотой.


Рис. 10. Спектр флуоресценции КТ CdS/ZnS (471 нм), модифицированных меркаптоуксусной кислотой.
Следует отметить, что в последнем случае переход в воду наночастиц практически не осуществился по тем же причинам, что и с точками CdSe/ZnSe.

Из вышеизложенного можно сделать вывод о том, что для перевода в воду квантовых точек лучше всего использовать меркаптокислоты с длинным углеводородным радикалом, например, меркаптоундекановую.
Приношу благодарность ведущему инженеру, к.х.н. Маняшину А.О. за помощь в проведении экспериментов.
Выводы

  1. Проведен анализ литературы по методам гидрофилизации поверхности КТ. Показано, что метод с использованием меркаптокислот в качестве модификаторов наиболее подходит для целей конъюгации нанокристаллов с биомолекулами.

  2. Проведен анализ литературы, посвященной методам пептидного синтеза. Сделан вывод, что вариант синтеза с карбодиимидом является наиболее перспективным.

  3. Модифицирована поверхность коллоидных квантовых точек CdSe/ZnSe и CdS/ZnS с использованием меркаптокислот. Опробованы методики с использованием меркаптоуксусной и меркаптоундекановой кислот.

  4. Произведены оценки качества модификации поверхности КТ на основании данных флуоресцентной спектроскопии.

  5. Улучшена методика гидрофилизации поверхности КТ CdSe/ZnSe и опробована на новом виде нанокристаллов - CdS/ZnS.

  6. Показано, что при увеличении длины углеводородного радикала меркаптокислоты улучшается качество модификации поверхности нанокристаллов.

Список литературы

  1. Олейников В.А., Суханова А.В., Набиев И.Р. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине // Российские нанотехнологии, том 2, №1-2 2007, стр.160 – 173.

  2. Якубке Х., Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки // стр. 140 – 160, 1985

  3. Sukhanova A., Venteo L., Devy J., Artemyev M., Oleinikov V., Pluot M., Nabiev I. Highly Stable Fluorescent Nanocrystals as a Novel Class of Labels for Immunohistochemical Analysis of Paraffin-Embedded Tissue Sections // Laboratory Investigation, Vol. 82, No. 9, p. 1259, 2002

  4. Bruchez M. Jr, Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A.P. // Science, 1998, V. 281, P. 2013.

  5. Gerion D., Pinaud F., Willimas S.C., Parak W.J., Zanchet D., Weiss S., Alivisatos A.P. // J. Phys. Chem. B, 2001, V. 105, P. 8861.

  6. Murray C.B., Norris D.J., Bawendi M.G. // J. Am. Chem. Soc., 1993, V. 115, P. 8706.

  7. Dabbousi B.O., Rodriguez-Viejo J., Mikulec F.V., Heine J.R., Mattoussi H., Ober R., Jensen K.F., Bawendi M.G. // J. Phys. Chem. B, 1997, V. 101, P. 9463.

  8. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсионные системы. Учебник для вузов. // М.: Химия, стр. 336, 1988