microbik.ru
1


G01N1/28
Способ определения мембранотропной активности криопротектора
Полезная модель относится к области криобиологии и может быть использована для сравнительной экспресс-оценки влияния различных криопротекторов на состояние липидного бислоя искусственных или природных (клеточных) мембран при подборе оптимального криопротектора, при тестировании новых веществ на их способность выступать в роли криопротекторов, а также для определения пороговых концентраций криопротекторов, которые могут быть применены при криоконсервировании клеток.

Сохранность биологических мембран - одни из наиболее криолабильных клеточных структур, в процессе криоконсервирования клеток человека и животных обеспечивают с помощью искусственного введения в консервирующую среду криозащитных веществ – криопротекторов (КП), которые в значительной степени ослабляют негативные последствия действия низких температур. В то же время, сами КП часто бывают неиндифферентными по отношению к клеткам. Многие из них способны повреждать клеточные мембраны и проявлять цитотоксическое действие еще до замораживания, на этапе эквилибрации клеток в криозащитных растворах и, таким образом, сенсибилизировать их к последующему действию понижения температуры и сопутствующих факторов. С другой стороны, даже один и тот же КП может по-разному влиять на мембраны одного типа клеток различных животных, что связано с видовыми различиями белок-липидного состава их цитоплазматических мембран. Таким образом, как для скрининга новых веществ – потенциальных КП, так и для оценки эффективности КП в отношении определенного вида клеток необходимо оценивать его влияние на структурное состояние клеточных мембран.

Известны способы определения мембранотропной активности веществ, основанные на измерении скорости выхода из эритроцитов гемоглобина в условиях действия кислоты или щелочи (кислотный или щелочной гемолиз) [1].

Однако, эти способы применимы только для эритроцитов и не могут быть использованы для клеток, не содержащих внутри гемоглобин. Кроме того, гемоглобин является высокомолекулярным белком и для его выхода требуется образованием в мембране крупных пор, свидетельствующих о существенных дефектах клеточных мембран, тогда как нарушения целостности мембран, сопровождающиеся образованием более мелких дефектов, также могут оказывать негативное влияние на функционирование клетки. К тому же, гетерогенность распределения эритроцитов по возрасту, наличие и неодинаковое количество холестерина в индивидуальных образцах не позволяют считать этот метод универсальным для оценки мембранотропных свойств КП. Известно также, что если зависимость степени гемолиза эритроцитов от концентрации малых гидрофильных молекул носит линейный характер, то для липофильных органических молекул, к которым может быть отнесена часть КП, эта зависимость носит нелинейный характер [2], что значительно осложняет интерпретацию и сопоставление результатов при сравнении мембранотропных свойств КП, относящихся к различным классам.

Существует способ определения мембранотропной активности веществ, основанный на введении в клетки маркера, например, флуоресцеиндиацетата, который внутри клеток гидролизуется эстеразами до свободного флуоресцеина, имеющего худшую проницаемость, что позволяет использовать его как маркер целостности плазматической мембраны [3].

Однако, применение данного метода также имеет ряд ограничений, среди которых можно отметить зависимость ферментативного превращения флуоресцеиндиацетата во флуоресцеин от активности внутриклеточных эстераз, на которую, в свою очередь, могут влиять факторы, нарушающие целостность или проницаемость мембран, а также способность флуоресцеина переноситься через мембрану с помощью специфических каналов или переносчиков – транспортных белков клеток печени. В клетках печени, кроме того, флуоресцеин может метаболизироваться монооксигеназной системой микросом. Все это может искажать результаты измерений при работе с клетками.

Известен также способ определения мембранотропной активности веществ по изменению проницаемости мембран клеток для парамагнитных ионов [4]. Для этого клетки насыщаются парамагнитными ионами, которые способны проникать внутрь клеток в норме, а затем сигнал от ионов, находящихся снаружи, уширяют добавлением специального реагента, не проникающего в клетки в норме. При нарушении нормальной проницаемости клеток реагент начинает поступать внутрь клеток и уширять сигнал от находящихся внутри клеток парамагнитных ионов, что является индикатором появления нарушений клеточной мембраны. К недостаткам метода относится то, что он позволяет определять только такие повреждения мембран, которые привели к образованию пор и не позволяет регистрировать нарушения, вызываемые КП на этапах, которые еще не приводят к образованию пор.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения мембранотропной активности веществ, основанный на регистрации сигналов ЭПР от введенных в мембраны парамагнитных зондов [5]. Способ состоит в том, что парамагнитный зонд (в отсутствие или в присутствии КП) вводят в исследуемые мембраны, после чего на ЭПР-спектрометре регистрируют спектр ЭПР зонда, производят его математическую обработку и строят график зависимости частоты вращательной диффузии зонда от концентрации КП, на основании которого судят о мембранотропной активности вещества.

К основным недостаткам этого способа относятся следующие:

- недостаточная чувствительность, связанная с тем, что для получения удовлетворительного отношения сигнал/шум требуется использование ЭПР-зондов в конечной концентрации не менее 4х10-45х10-5 М [6]. Подобные концентрации ЭПР-зондов являются достаточно высокими и сами по себе могут оказывать возмущающее влияние на липидный бислой мембран. В случае же использования более низких концентраций зондов требуется накопление сигналов, которое увеличивает время измерения;

- сложность интерпретации результатов, заключающаяся в том, что даже в случае использования одного и того же ЭПР-зонда, интерпретация спектров часто осложнена из-за наложения спектров ЭПР этого зонда, локализующегося в водной фазе и в различных областях мембран;

- высокие временные затраты, обусловленные спецификой подготовки образца для ЭПР-измерений, требующей его помещения в капилляр, юстировки в резонаторе, настройки параметров поля и т.п. Для получения адекватной информации о состоянии различных областей бислоя, обычно используют поочередно (то есть, в разных экспериментах) несколько различных ЭПР-зондов, что увеличивает время измерений, которое для одного образца составляет 15 и более мин, и время обработки спектров;

- высокая стоимость ЭПР-зондов, применяемых для исследования.

В основу изобретения поставлена задача создания такого способа определения мембранотропной активности КП, который, за счет использования другого мембранного зонда позволит повысить чувствительность метода, снизить материальные и временные затраты.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения мембранотропной активности КП, включающем введение зонда в исследуемые мембраны, измерение его спектра и последующую математическую обработку спектральных данных и построение графика зависимости измеренных спектральных параметров от концентрации КП, согласно полезной модели, в мембраны вводят флуоресцентный зонд, на спектрофлуориметре регистрируют его спектр флуоресценции, после чего проводят математическую обработку спектральных данных, состоящую в том, что по спектрам определяют интенсивность флуоресценции (F) зонда на длинах волн А и Б, где А находится в пределах 480–535 нм, Б – в пределах 540–650 нм, строят зависимость отношения этих интенсивностей FА/FБ от концентрации КП и по увеличению отношения FА/FБ в сравнении с аналогичным параметром, измеренным для данного вида мембран в отсутствие КП, судят о мембранотропной активности КП.

В качестве флуоресцентного зонда используют мультипараметрический зонд ФМЕ, являющийся представителем класса 3-гидроксифлавонов. При электронном возбуждении зонды этого класса способны изомеризоваться, образуя нормальную (N*) и таутомерную (T*) формы [7]. Положение и интенсивность полос эмиссии каждой из форм зависят не только от химической структуры зонда, но и от параметров окружения его молекул, таких как полярность, вязкость, и способности образовывать межмолекулярные водородные связи [8]. В мембранах ФМЕ локализуется на границе полярной и неполярной областей липидного бислоя, что обеспечивает его высокую чувствительность к начальным изменениям структуры неполярной зоны бислоя. При этом, двухполосной флуоресценцией обладают только молекулы зонда, локализованного в мембране. Это позволяет отличать сигнал флуоресценции ФМЕ, находящегося в мембранах, от флуоресценции зонда, находящегося в растворителе (водной или водно-криопротекторной среде).

Использование флуоресцентного зонда ФМЕ и отношения интенсивностей полос флуоресценции FА к FБ для определения мембранотропной активности КП позволяет:

– повысить чувствительность способа за счет использования на порядок более низкой (10-6 М), в сравнении с методом ЭПР, концентрации флуоресцентного зонда;

– облегчить интерпретацию данных за счет того, что в флуоресценция ФМЕ наблюдается только из мембран, а в водном растворе она почти полностью затушена водой и не мешает спектральным измерениям;

– сократить время измерений до 1 мин и снизить трудоемкость метода за счет изменения методики измерения, упрощения процедуры подготовки образца и математической обработки результатов в сравнении с методом ЭПР, а также использованием для определения мембранотропной активности КП одного вещества, чувствительного к структурным изменениям как поверхностной, так и неполярной областей мембран;

– удешевить определения за счет использования флуоресцентного зонда, стоимость которого на 3 порядка ниже стоимости ЭПР-зондов. Так, например, стоимость ФМЕ составляет около $5 за 1 г, флуоресцентный зонд флуоресцеин диацетат (катал. номер F7378) стоит $3.88 за 1 г [9], тогда как широко распространенный мембранный ЭПР-зонд 5-доксил стеариновая кислота (катал. номер 25,363-4), стоит $50600 за 1 г [10].
Способ осуществляют следующим образом.

Флуоресцентный зонд ФМЕ добавляют в количестве 2-10 мкл к 2–3 мл суспензии искусственных или природных мембран (без КП) в виде спиртового раствора с начальной концентрацией 5х10-40,5х10-3 М. Конечная концентрация зонда в суспензии исследуемых мембран составит 0,55х10-6 М. После 10–15-минутной инкубации образца с зондом измеряют его спектр флуоресценции, выбирая длину волны возбуждения в области 380-440 нм. По полученным спектрам флуоресценции находят значения интенсивностей FА и FБ, измеренные на длинах волн А и Б, где А находится в пределах 480-535 нм, а Б находится в пределах 540-650 нм и определяют соотношение FА/FБ. Аналогичные измерения проводят для образцов, содержащих различные концентрации КП. По измеренным значениям интенсивностей флуоресценции строят зависимость (FА/FБ) от концентрации КП и по увеличению наклона графика в сравнении с контролем судят о мембранотропной активности КП.
Предложенный способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Флуоресцентный зонд ФМЕ растворяли в спирте до начальной концентрации 3х10-3 М. 10 мкл спиртового раствора ФМЕ добавляли к 2,0 мл суспензии липосом, приготовленных из яичного фосфатидилхолина (с содержанием липида 2,0 мг/мл), инкубировали 10 мин и измеряли спектр флуоресценции зонда в области 410–650 нм на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse (США) при ширине щелей монохроматоров возбуждения и флуоресценции 5 и 5 нм соответственно и длине волны возбуждения 405 нм. После этого по полученным спектрам находили максимумы флуоресценции зонда на длинах волн А и Б, которые выбирали при 515 и 575 нм соответственно. Определяли соотношение интенсивностей флуоресценции F515/F575. Оно было равно 0,57. Аналогичные измерения проводили для образцов, содержащих, кроме ФМЕ, 5, 10, 20, 30 и 40 об. % диметилсульфоксида (ДМСО). По измеренным значениям интенсивностей флуоресценции ФМЕ при 515 и 575 нм строили зависимости F515/F575 от концентрации ДМСО и по резкому излому графика кверху определяли начальную концентрацию ДМСО, вызывающую нарушение упаковки мембран. Она составила 12 об. %.
Пример 2.

Флуоресцентный зонд ФМЕ растворяли в спирте до начальной концентрации 3,5х10-3 М. 10 мкл спиртового раствора ФМЕ добавляли к 2,0 мл суспензии липосом, приготовленных из суммарных липидов сперматозоидов петуха (с содержанием липида 1,0 мг/мл), инкубировали 15 мин и измеряли спектр флуоресценции зонда, как описано в примере 1. Определяли соотношение интенсивностей флуоресценции зонда на длинах волн А и Б, которые выбирали при 515 и 575 нм соответственно. Отношение F515/F575 составило 0,57. Аналогичные измерения проводили для образцов, содержащих, кроме ФМЕ, 5, 10, 20, 30 и 40 об. % диметилформамида (ДМФА). По измеренным значениям интенсивностей флуоресценции строили зависимость F515/F575 от концентрации ДМФА и по резкому излому графика кверху определяли начальную концентрацию ДМФА, вызывающую нарушение упаковки мембран. Она составила 7,5 об. %.
Пример 3.

Флуоресцентный зонд ФМЕ растворяли в спирте до начальной концентрации 0,7х10-3 М. 20 мкл спиртового раствора ФМЕ добавляли к 2,0 мл суспензии микросомальных мембран, выделенных из печени крысы (с содержанием общего белка 0,75 мг/мл), инкубировали 15 мин и измеряли спектр флуоресценции зонда, как описано в примере 1. Определяли соотношение интенсивностей флуоресценции зонда на длинах волн А и Б, которые выбирали при 515 и 575 нм соответственно. Оно составило 0,45. Аналогичные измерения проводили для образцов, содержащих, кроме ФМЕ, 5, 10, 20, 30 и 40 об. % ДМСО. По измеренным значениям интенсивностей флуоресценции строили зависимость F515/F575 от концентрации ДМСО и по резкому излому графика кверху определяли начальную концентрацию ДМСО, вызывающую нарушение упаковки микросомальных мембран. Она составила 12 об. %.
Источники информации:

1. Иванов И.Т. Сравнение механизмов кислотного и щелочного гемолиза эритроцитов человека // Биофизика.– 2001.– Т. 46, вып. 2.– С. 281-290.

2. Черницкий Е.А., Сенькович О.А., Козлова Н.М. Гетерогенность пор, образуемых в мембране эритроцитов липофильными гемолитиками // Биофизика.– 1996.– Т. 41, вып. 6.– С. 1270-1275.

3. Бондаренко В.А., Коптелов В.А., Лежанин С.Н., Олейник О.А., Рамазанов В.В., Середа Т.П. Зависимость интенсивности транспорта флуоресцеина от температуры среды // Проблемы криобиологии.– 2001.– № 1.– С. 3-7.

4. А.с. 1384006 СССР, МКИ4 G01 N 24/10. Способ определения проницаемости эритроцитов для осмотически активных органических веществ / С.Х. Межидов, О.А. Нардид, В.А. Моисеев.– Опубл. 1995, Бюл. № 14.

5. Иванов Л.В., Ляпунов Н.А., Цымбал Л.В. и др. Влияние состава двухкомпонентных растворителей на биологические мембраны // Хим.-фарм. журнал.- 1988.- № 1.- С. 1437-1443.

6. Цымбал Л.В., Нардид Я.О. Проницаемость мембран эритроцитов, модифицированных высокими температурами и сульфгидрильными реагентами Актуальные проблемы медицины и биологии // Сборник научн. тр., Киев, 2004.- C. 185-189.

7. Sengupta P. K., and Kasha M. Excited state proton-transfer spectroscopy of 3-hydroxyflavone and quercetin // Chem. Phys. Lett.-1979.- Vol. 68.-№ 2-3.-P. 382-385.

8. Pivovarenko V. G., Tuganova A. V., Klymchenko A. S., Demchenko. A. P. Flavonols as models for fluorescent membrane probes. 1. The response to the charge of micelles// Cellular & Molecular Biology Letters.-1997.- No 2.-P. 355-364.

9. Каталог «Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук» (Sigma), 1999. C. 2196.Там же. C. 451.

10. Там же. C. 451.


Авторы:

Грищенко Валентин Иванович, Дюбко Татьяна Станиславовна,

Пивоваренко Василий Георгиевич, Линник Тамара Павловна

Реферат


Способ определения мембранотропной активности криопротектора относится к области криобиологии и может быть использован для сравнительной экспресс-оценки влияния различных криопротекторов на состояние липидного бислоя искусственных или природных (клеточных) мембран при подборе оптимального криопротектора; при тестировании новых веществ на их способность выступать в роли криопротекторов; а также для определения максимально допустимых концентраций криопротекторов, которые могут быть применены при криоконсервировании клеток. Определение мембранотропной активности криопротектора осуществляют путем введения в мембраны флуоресцентного зонда, регистрации его спектра флуоресценции, математической обработки спектральных данных, состоящей в том, что по спектрам определяют интенсивность флуоресценции (F) зонда на длинах волн А и Б, где А находится в пределах 480 – 535 нм, Б – в пределах 540 – 650 нм, строят зависимость отношения этих интенсивностей FА/FБ от концентрации криопротектора и по увеличению отношения FА/FБ в сравнении с аналогичным параметром, измеренным для данного вида мембран в отсутствие криопротектора, судят о его мембранотропной активности. В качестве флуоресцентного зонда используют мультипараметрический зонд ФМЕ, являющийся представителем класса 3-гидроксифлавонов. Предложенный способ позволяет повысить чувствительность метода, облегчить интерпретацию данных, сократить время измерений, материальные и трудовые затраты.

Формула изобретения


Способ определения мембранотропной активности криопротектора, включающий введение в мембраны флуоресцентного зонда, регистрацию его спектра флуоресценции, проведение математической обработки спектральных данных, состоящей в том, что по спектрам определяют интенсивность флуоресценции (F) зонда на длинах волн А и Б, где А находится в пределах 480 – 535 нм, Б – в пределах 540 – 650 нм, строят зависимость отношения этих интенсивностей FА/FБ от концентрации криопротектора и по увеличению отношения FА/FБ в сравнении с аналогичным параметром, измеренным для данного вида мембран в отсутствие криопротектора, судят о его мембранотропной активности, отличающийся тем, что в качестве зонда используют мультипараметрический флуоресцентный зонд ФМЕ, являющийся представителем класса 3-гидроксифлавонов.