microbik.ru
  1 ... 2 3 4 5

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА НОР2 С КОРОТКИМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ И РЕАКЦИЯ ОБМЕНА НИТЕЙ ДНК В ЭТОЙ СИСТЕМЕ
А.А. Володин

Лаборатория молекулярной биофизики.

Белок Hop2 является элементом системы гомологичной рекомбинации у эукариот. Он действует на ранних стадиях мейоза и участвует в обеспечении специфичности взаимодействия гомологичных хромосом. Ранее было показано, что этот белок обладает способностью формировать D-петли в системе олигонуклеотид-плазмидная ДНК, характерной для белков гомологичной рекомбинации (белка RecA и ему подобных).

Мы обнаружили, что белок Hop2 подобно белкам гомологичной рекомбинации проявляет способность катали-зировать обмен нитей между короткими олигонуклеотидами, но механизм этой реакции существенно отличается от механизмов реакций с участием RecA - подобных рекомбиназ таких, напри-мер, как белки Rad51 и Dmc1, охарактеризованные нами ра-нее. В частности, реакция с участием Hop2 не требует нуклеотидного кофактора и присутствия ионов двухвалентных металлов.

Наиболее существенной особенностью реакции обмена нитей в присутствии белка Hop2 является её высокая чувстви-тельность к нарушениям гомологии между молекулами ДНК, участвующими в обмене. Как мы показали ранее, в реакциях с участием белка RecA из E.coli, и в особенности белков Rad51 и Dmc1 человека, чувствительность к нарушениям гомологии между партнёрами реакции значительно снижена по сравнению со случаем спонтанного обмена нитей между свободными молекулами ДНК, происходящего при повышенной температуре. В отличие от этого, реакция обмена нитей в присутствии белка Hop2 характеризуется чувствительностью к нарушению гомологии, сравнимой с чувствительностью спонтанного обмена между свободными молекулами ДНК.

Такая высокая чувствительность к нарушениям гомологии характерна для реакций обмена нитей между олигонук-леотидами в присутствии некоторых синтетических полика-тионов, описанных в литературе, и, согласно нашим предва-рительным данным, сильнозаряженных основных белков, таких как гистоны и протамины. Это позволяет предполагать, что в механизме взаимодействия белка Hop2 с ДНК определяющую роль играют электростатические силы.

Репликация и репарация ДНК человека: характеристика ДНК-полимеразы йота и ORI-элемента, прилежащего к гену 2-интерферона
В.З. Тарантул

Отдел вирусной и клеточной молекулярной генетики (ОВКМГ)

Лаборатория репликации и репарации генома ОВКМГ
Проблема репликации и репарации ДНК у эукариот еще далека от своего полного решения. Остаются неясными как особенности структурной организации участков начала репликации (ori), так и роль многочисленных ДНК-полимераз, участвующих в процессах инициации и элонгации а репликации, а также репарации ДНК.

Ранее нами с помощью количественной ПЦР на вновь синтезированных молекул ДНК был обнаружен участок начала репликации в геноме человека, который расположен в 3’-фланкирующей области гена альфа2-интерферона (ori-α2-INF). Показано, что по уровню своей активности этот элемент сходен (или сильнее) в сравнении с несколькими ранее детально охарактеризованными ori-элементами человека, но отличается от них меньшими размерами и наличием в ближайшем окружении многочисленных S/MARs-элементов. Выяснено также, что эффективность репликации ДНК, определяемой ori-α2-INF, отличается в разных типах клеток. Проводится работа по созданию на основе ori-α2-INF вектора, способного обеспечивать эффективную экстрахромосомную репликацию целевого гена в клетках человека.

Для более детального изучения свойств некорректной ДНК-полимеразы йота (Pol i), участвующей в процессах репликации и репарации ДНК, были получены дрожжевые продуценты как дикого типа этого фермента, так и его различных мутантных форм. Показано, что некорректная активность, детектируемая нами в экстрактах клеток тканей млекопитающих по встраиванию дГТФ напротив тимина матрицы («дГТФ-Т» активность), действительно является активностью Pol ι, поскольку:

- установлено, что некорректная активность Pol ι отсутствует у мышей линии 129/J, несущих нонсенс-мутацию во втором экзо-не гена pol i;

- ферментативные свойства Pol ι, детектируемые в экстрактах органов млекопитающих, совпадают со свойствами экзогенной Pol ι человека в экстрактах клеток дрожжей-продуцентов и со свойствами чистого ферментного препарата;

- максимальная специфическая «дГТФ-Т» активность в экстрактах клеток эукариот тестируется, как и у чистого фермента, в присутствие низких концентраций ионов Mn2+;

- введение рекомбинантной плазмиды с геном pol i человека в икринки вьюна приводит к появлению специфической «дГТФ-Т» активности в экстрактах ранних эмбрионов рыб, которая в норме в них полностью отсутствует.

Изучение ферментативной активности мутантных форм Pol i показало, что для функционирования Pol i достаточно наличия первых 420 аминокислот из 715 а.к., содержащихся в ферменте дикого типа. Отсутствие 2-го экзона в гене pol i приводило к полной потере активности фермента в экстрактах дрожжей. Замены эволюционно-консервативных аминокислот D126 и E127 на аланин вызывали резкое снижение как общей, так и некорректной активности Рol ι. Как теоретически и предсказывалось нами ранее, появление некорректной активности Pol ι у млекопитающих по крайней мере частично связано с заменой Leu62Ile в активном центре фермента, поскольку обратная замена в гене дикого типа человека снижала «дГТФ-Т» активность фермента более, чем в 4 раза.

Регуляция процессов пролиферации, дифференци-ровки и функционирования соматических клеток млекопитающих in vitro с помощью генетических и химических факторов
И.А. Гривенников

Лаборатория молекулярной генетики соматических клеток ОВКМГ
Основные направления исследований в Лаборатории в 2008 году, как и в предыдущие годы, были связаны с изучением функций отдельных генов, разнообразных факторов, регулирующих их экспрессию, в процессах пролиферации, дифференцировки и обеспечения жизнеспособности эукариотических клеток.

Изучено влияние повышенной и пониженной экспрессии генов pub человека (hpub) и мыши (mpub) на способность эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши линии R1 дифференцироваться по экто-, мезо- и энтодермальному путям. Не обнаружено влияния этих генов на дифференцировку ЭС клеток мыши в энтодермальном направлении. Усиление экспрессии гена hpub стимулирует ЭС клетки мыши к дифференцировке в мезодермальном направлении и в то же время оказывает негативное влияние на эктодермальную дифференцировку этих клеток.

При изучении влияния экспрессии гена нейротрофического фактора глии (gdnf) человека на дифференцировку трансфицированных им ЭС клеток методом ОТ-ПЦР было показано, что в этой линии клеток осуществляется экспрессия генов рецепторов для этого фактора: RET и GFRα1. На следующем этапе работы было изучено влияние экзогенного GDNF на нейрональную дифференцировку ЭС клеток путем добавления этого фактора к культивируемым эмбриоидным телам. Через 20 дней дифференцировки иммуноцитохимическим окрашиванием антителами к бета- III тубулину и тирозингидроксилазе выявлено значительное увеличение количества бета- III тубулин- и тирозингидроксилаза-положительных клеток по сравнению с контролем.

Продолжены исследования по изучению механизмов действия меланокортинов и их аналогов, в первую очередь пептида Семакс, на центральную нервную систему млекопитающих (ЦНС). Обнаружена дозозависимая стимуляция уровней белка BDNF в культуре первичных нейронов гиппокампа крысы в присутствии эндогенных меланокортинов: альфа-МСГ и фрагмента АКТГ (1-10). Обнаружено увеличение уровней BDNF в гиппокампе и коре больших полушарий мозга мышей с низкой эффективностью исследовательского поведения (НЭИП) при субхроническом введении Семакса. При этом в группах с высокой эффективностью исследовательского поведения изменений уровней BDNF при введении Семакса обнаружено не было.

Публикации Отдела вирусной и клеточной

молекулярной генетики
1. Manuilova E.S., Arsenyeva E.L., Khaidarova N.V., Shugurova I.M., Inozemtseva L.S., Tarantul V.Z., Grivennikov I.A. Different effects of regulatory genes (tat, nef) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) on the proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells in vitro. Int. J. Biomed. Sci., 2008, 4, 100-108.

2. Kholodii G., Dantsevich O., Tarantul V. New origins of DNA replication identified near the human IFNA2 gene. Cell Cycle, 2008, 7, issue 24, 40-42.

3. Grivennikov I.A., Dolotov O.V., Zolotarev Yu.A., Andreeva L.A., Myasoedov N.F., Leacher L., Black I.B., Dreyfus C.F. Effects of behaviorally active ACTH (4-10) analogue – Semax on rat basal forebrain cholinergic neurons. Restorative Neurology and Neuroscience, 2008, 26, 1, 35-43.

4. Teixeira D.I.A., Lopes-Júnior E.S., Sousa F.C., Pinheiro E.S.P., Serova I.A., Andreeva L.E., Freitas V.J.F. The use of real-time ultrasonography to select embryo donors participating in a transgenesis goat programme. Small Ruminant Research, 2008, 76, 215-219.

5. Buravkova L.B., Romanov Yu.A., Konstantinova N.A., Buravkov S.V., Gershovich Yu.G., Grivennikov I.A. Cultured stem cells are sensitive to gravity changes. Acta Astronautica, 2008, 63, 603-608.

6. Макарова А.В., Тарантул В.З., Генинг Л.В. Эволюция структуры и функции ДНК-полимеразы йота у эукариот. Биохимия, 2008, 73, 3, 426-433.

7. Андреева Л.Е., Хайдарова Н.В., Слепцова Л.А., Родригес-Бланко Е.В., Дичева М.А., Дворянчиков Г.А., Тарантул В.З. Эффект регуляторных последовательностей αS1- казеинового гена на экспрессию lacZ-гена в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L. Генетика, 2008, 44, 992-999.

8. Завалишин И.А., Бочков Н.П., Суслина З.А., Захарова М.Н., Тарантул В.З., Народицкий Б.С., Супонева Н.А., Иллариошкин С.Н., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Тутыхина И.Л., Верховская Л.В., Седова Е.С., Васильев А.В., Брылёв Л.В., Гинцбург А.Л. Генная терапия бокового амиотрофического склероза. Бюлл. экспер. биол. и медицины, 2008, 145, 467-470.

9. Костров С., Тарантул В. Трудные пути молекулярной генетики. Наука в России, 2008, 5, 24-31.

10. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдаро-ва Н.В., Лебедев А.Н., Тарантул В.З., Гривенников И.А. Повы-шенная экспрессия гена hpub стимулирует лимфоидную диффе-ренцировку эмбриональных стволовых клеток мыши, но не образование фокусов злокачественной трансформации in vitro. Медицинская генетика, 2008, 8, 43-46.

11. Казаков А.А., Генинг Л.В., Гришина Е.Е., Петроченков А.Н., Тарантул В.З. Изменение баланса активности ДНК-полимераз в некоторых злокачественных опухолях. Медицинская генетика, 2008, 9, 32-39.

11. Макарова А.В., Генинг Л.В., Макарова И.В., Тарантул В.З. Активность ошибочной ДНК-полимеразы йота в различные периоды онтогенеза домашней мыши Mus musculus. Онтогенез, 2008, 39, 5, 367-373.

12. Иноземцева Л.С., Карпенко Е.А., Долотов О.В., Левицкая Н.Г., Каменский А.А., Андреева Л.А., Гривенников И.А. Пептид Селанк регулирует экспрессию BDNF в гиппокампе крысы in vivo при интраназальном введении. Доклады Российской Академии Наук, 2008, 421, 842-844.

13. Гривенников И.А. Эмбриональные стволовые клетки и проблемы направленной дифференцировки. Успехи биологической химии, 2008, 48, 181-220.
Полиморфизм белковых и генетических маркеров, ассоциированных с нарушениями иммунной системы
В.В. Демкин

Лаборатория молекулярной диагностики
Научная деятельность велась по двум направлениям.

1. Изучение взаимодействия синтетических пептидов с сыво-ротками от больных ревматоидным артритом (РА).

Исследование иммунохимического взаимодействия нескольких пептидов с сыворотками от пациентов с различными заболеваниями и здоровых людей показало, что только 2 пептида реагировали с сыворотками от больных РА. Определены особенности иммунохимических реакций между пептидами и антителами с использованием различных конъюгатов. Испытывали девять конъюгатов с пероксидазой хрена в двух модельных системах: вторичные антитела IgG к IgG человека и белок А четырёх производителей. В модельных экспериментах использовали пептид ИМГ3. Все испытанные конъюгаты связывались с антителами из сывороток больных РА. Наиболее специфичное связывание было показано при использовании конъюгата белка А с пероксидазой хрена. Собрана и описана коллекция из более, чем 150 сывороток от больных РА. Проведены исследования иммунохимических свойств базовой выборки сывороток от больных ревматоидным артритом в модельной системе с конъюгатом на основе белка А. Чувствительность определения иммунореактивных антител в сыворотках от больных РА в тесте с пептидом ИМГ3 составляла около 81%. Определение антител к филаггрину давало положительные результаты уже на ранних стадиях и при низкой активности ревматоидного артрита.

  1. Разработка подходов к мультиплексной идентификации герпесвирусов.

При полноразмерном сравнении геномов вируса Варицелла-Зостер (ВЗВ) и вируса простого герпеса (ВПГ) наибольший уровень межвидовой гомологии был обнаружен у некоторых генов, кодирующих ферменты синтеза и метаболизма вирусной ДНК. Для разработки системы комплексной дифференциации и идентификации герпесвирусов был выбран ген ДНК-полимеразы, в котором имелись участки гомологии для большой группы герпесвирусов. Разработаны группоспецифические праймеры, с помощью которых можно амплифицировать специфический фрагмент ДНК вирусов ВПГ1, ВПГ2, ЦМВ и ВЭБ. Разработаны Taqman-зонды, с помощью которых можно установить видовую принадлежность вируса. Изучалось влияние внутримолекулярных шпилек различной протяженностью в структуре праймеров на эффективность диагностических реакций с целью добиться наилучших показателей по чувствительности и специфичности. В результате были отобраны наиболее эффективные комбинации праймеров и зондов и разработан метод детекции и идентификации 4-х видов герпесвирусов на основе технологии реал-тайм ПЦР с Taqman-зондами. Разработанный метод может служить прототипом тест-системы для медицинских целей и имеет перспективу коммерческого использования.
Диагностическая деятельность традиционно велась с использованием двух методов: ПЦР и ИФА. В 2008 г. по договорам с медицинскими организациями проведено 29 тыс. ПЦР-анализов и 7 тыс. ИФА-анализов на общую сумму 3,7 млн. руб., что несколько ниже показателей 2007 г.
Публикации Лаборатории молекулярной диагностики:
1. Демкин В.В., Корнева И.Н., Рязанова Ю.А., Муминов Т.А., Бейсембаева Ш.А., Жакипбаева Б.Т., Шопаева Г.А., Даулетбакова А.М. RD7 генотипирование штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных легочным туберкулезом на территории Казахстана. Молекулярная генетика, микробио-логия, вирусология, 2008, 2, 18-22.

2. Литвинов В., Черепахина Н., Санаев А., Котенко О., Матушевский И., Величковский Б., Винницкий Л., Перлин Д., Демкин В., Сучков С. Хронический пиелонефрит: особенности иммунопатогенеза и принципы клинической иммуногенодиаг-ностики. Врач, 2008, 1, 12-17.
Разработка концепции конструирования пептидов с направленным физиологическим действием
Н.Ф. Мясоедов

Отдел химии физиологически активных веществ (ОХФАВ)
В течение уже многих лет пептиды привлекают внимание фармакологов как перспективный класс химических соединений для создания на их основе новых лекарственных препаратов. Эндогенные пептиды являются природными регуляторами многих физиологических функций человека и животных. Они имеют эндогенные мишени действия, а в организме имеются ферментные системы их быстрой деградации. В отчетный период в Отделе активно развивались работы по химии и биологии пептидов как основы создания новых лекарственных препаратов пептидной природы.

В докладе рассматриваются принципы конструирования и особенности создания субстанций для лекарственных препаратов пептидной природы. Это проводится на базе обобщения экспериментальных данных по созданию пептидов Семакс, Селанк, новых нейролептиков, анальгетиков, противовирусных препаратов, которые являются основой создания субстанций для лекарственных препаратов. Обсуждаются вопросы структурно-функциональных особенностей этих пептидов на базе данных биологических, физиологических, структурных исследований, а также по влиянию отдельных аминокислотных остатков на протеолитическую устойчивость этих пептидов.

Выявлены и охарактеризованы иммунотропные и противовирусные свойства Селанка и его структурных аналогов, определен фармакофор, ответственный за противовирусные свойства этого пептида. Проведенные исследования позволят расширить число пептидов, обладающих противовирусными свойствами по отношению к мало контролируемым инфекцион-ным заболеваниям.

Приводятся данные по структуре и физиологическим свойствам коротких пептидов, обладающих анальгетическими свойствами, а также по влиянию конформации на их свойства.

Охарактеризована группа пептидов, обладающая нейро-лептическим действием, сходным с действием современных антипсихотиков. Разработаны оригинальные подходы к исследованию синтезированных пептидов. Полученные результаты открывают возможность для дальнейшей работы по созданию лекарственных препаратов на основе пептидов без побочных эффектов в качестве антипсихотических препаратов.

Отдельно рассматривается вопрос механизма действия исследуемых пептидов, а так же продуктов их протеолиза, как на клеточном уровне, так и на уровне активации отдельных генов.


<< предыдущая страница   следующая страница >>