microbik.ru
1 2 3 4


На правах рукописи
ФЕДОРОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ СТРОБИЛУРИНОвых фунгицидов ДЛЯ ГИДРОБИОНТОВ

03.02.08 – экология (биологические науки)


А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Ростов-на-Дону-2012

Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования

Южного федерального университета, в Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (ФГУП «АзНИИРХ»)

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Левина Ирина Леонидовна
Официальные оппоненты: Корниенко Галина Гавриловна, доктор биологических наук, профессор, зав. отделом генетико-биохимического мониторинга Азовского научно-исследовательского института рыбного хозяйства

Кренева Софья Викторовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела океанографии и биологии южных морей Азовского филиала Мурманского морского биологического института КНЦ РАН

Ведущая организация: Институт биологии Карельского научного центра РАН, г. Петрозаводск

Защита диссертации состоится 30 марта 2012 г. в 15-00 на заседании диссертационного совета Д 212.208.32 по биологическим наукам при Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105, ЮФУ, ауд. 304, e-mail: denisova777@inbox.ru, факс: (8632638723).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан « » февраля 2012 г. и размещен в сети Интернет на сайте ЮФУ www.sfedu.ru и на сайте Минобрнауки России www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Денисова Т.В.

Общая характеристика работы

Актуальность исследований. Изменение свойств водной среды в результате использования химических загрязнений нанесло значительный ущерб биопродуктивности многих водоемов (Брагинский, 1998). Особенно остро это проявилось уже 60 – 70 годы XX столетия. Стало очевидным, что использование разных классов веществ оказывают губительное влияние на водные экосистемы. Пестициды – выступают одним из важных факторов загрязнения окружающей среды (Потапов, Ястребов, 1998; Соколов и др., 2001). Однако, ни одна страна мира в настоящее время не смогла отказаться от использования пестицидов, что, в свою очередь приводит к неизбежному попаданию этих химических соединений в водоемы. Находясь в водной среде, пестициды могут вызывать различные патологические изменения, как у отдельных гидробионтов, так и у целых сообществ (Федоров, Яблоков, 1999).

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что сравнительно полные токсиколого-биохимические исследования на гидробионтах проведены лишь при изучении действия пестицидов, которые используются в сельском хозяйстве уже несколько десятилетий (это хлор- и фосфорорганические соединения, карбаматы, пиретроиды). Доказана их высокая токсичность для водных сообществ.

В настоящее время создаются пестициды новых поколений (Грапов, 1995; Plimmer, 1996). Важным является изучение поведения таких современных пестицидов в водных экосистемах. Последнее вызвано тем, что гидробионты, вследствие определенных физико-химических особенностей самой среды обитания и процессов их взаимодействия с этой средой, оказываются в большинстве случаев наиболее чувствительными к антропогенному загрязнению экосистем (Врочинский, Мухопад, 1988; Брагинский, 1998).

Стробилурины представляют собой новое, 4-е поколение, фунгицидов с очень широким спектром трансламинарного мезосистемного действия, обладающие высокой эффективностью в борьбе практически со всеми грибковыми заболеваниями растений (Рубчиц, 2005). Они обладают новым механизмом фунгицидного действия: подавляют митохондриальное дыхание в грибах путем блокировки перемещения электронов в цитохромах «b» и «с» дыхательной цепи (Багодский, Санин, 1991).

В известной нам литературе практически нет сведений о влиянии стробилуринов на водные объекты, не исследованы механизмы токсического действия на гидробионтов, не налажена на должном уровне система мониторинга этих соединений в водоемах. Тем не менее, использование стробилуринов в сельском хозяйстве, как современных средств защиты растений, увеличивается год от года, в результате возрастает опасность попадания их в водоемы.

Вследствие этого, актуальным является изучение влияния стробилуриновых фунгицидов на формирование структурно-метаболических и биологических нарушений у гидробионтов разных систематических групп.

Цель и задачи исследования. Цель работы – оценка токсичности стробилуриновых фунгицидов для гидробионтов на основе изучения патологических, адаптивных и детоксикационных процессов у них.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

  1. Установить токсикометрические параметры стробилуриновых фунгицидов (Трифлоксистробин, Пиракластробин, Димоксистробин и Флуоксастробин) для представителей зоопланктона, зообентоса и рыб в различных фазах онтогенеза (предличинки осетровых рыб, сеголетки карпа).

  2. Изучить изменения интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), состояние систем I и II фаз детоксикации и антиоксидантной защиты у карповых рыб и брюхоногих моллюсков при действии фунгицидов на ранних стадиях развития токсического процесса.

  3. Изучить влияние стробилуринов на биохимические процессы у сеголеток карпа в условиях длительного 15-ти суточного эксперимента.

  4. Исследовать действие стробилуринов на биологические показатели жизнедеятельности зоопланктонных организмов в хроническом эксперименте.

  5. Изучить влияние стробилуринов на эмбриональное и раннее постэмбриональное развитие осетровых рыб.

  6. Определить порог чувствительности у разных видов гидробионтов к действию стробилуринов.

Научная новизна работы. В работе впервые проведена комплексная оценка токсического действия стробилуриновых фунгицидов на ветвистоусых ракообразных, брюхоногих моллюсков и рыб в различных фазах онтогенеза (эмбрионы и предличинки осетровых рыб, сеголетки карпа) в условиях острых и хронических экспериментов - это позволяет оценивать химическое поражение на разных стадиях патологического процесса. Проведен сравнительный анализ интенсивности процессов перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты, первой и второй фаз детоксикации у рыб и брюхоногих моллюсков при интоксикации стробилуринами. Впервые изучены основные показатели жизнедеятельности ветвистоусых ракообразных, пластического обмена у осетровых рыб на ранних стадиях онтогенеза, установлены аномалии развития эмбрионов и предличинок при действии фунгицидов данного класса.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований вносят значительный вклад «в базу данных» по водной токсикологии. Проведенные исследования позволяют выявить закономерности формирования адаптивных и патологических процессов у гидробионтов в ответ на краткосрочное и длительное воздействие стробилуриновых фунгицидов и оценить их потенциальную опасность для водных организмов.

Практическая значимость работы заключается в следующем: определены токсикометрические параметры и дозоэффективные зависимости воздействия изученных фунгицидов для гидробионтов разных систематических групп, установлены наиболее чувствительные тест-объекты при интоксикации стробилуринами. Найдены информативные биохимические и биологические параметры, характеризующие развитие в организмах гидробионтов пестицидной интоксикации, которые могут быть использованы при проведении эколого-токсикологического мониторинга водных экосистем. На основе изучения показателей жизнедеятельности 4-х поколений ветвистоусых ракообразных при действии фунгицидов впервые определены пороги чувствительности зоопланктонных организмов к действию стробилуринов, что является необходимым условием обоснования безвредных уровней содержания их в воде рыбохозяйственных водоемов.

Разработанный комплекс показателей используется в научных исследованиях отдела рыбохозяйственной токсикологии ФГУП «АзНИИРХ». Материалы проведенных исследований легли в основу разработки 4-х рыбохозяйственных нормативов (ПДК) стробилуриновых фунгицидов.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Исследованные стробилурины (Трифлоксистробин, Пиракластробин, Димоксистробин и Флуоксастробин) особо токсичны для зоопланктона; особо- либо высокотоксичны для рыб на разных стадиях жизненного цикла (от эмбрионов до взрослых особей). Для зообентоса острая токсичность стробилуринов возрастает от среднетоксичного Флуоксастробина до особотоксичного Димоксистробина.

  2. Закономерности формирования биохимических адаптивных и патологических процессов у гидробионтов при действии стробилуринов:

а) действие Пираклостробина и Трифлоксистробина на уровне минимальных летальных концентраций (ЛК16) в начальные сроки интоксикации (1-е - 4-е сутки) вызывает нарушение про/анти-оксидантного баланса в тканях сеголетков карпа и брюхоногих моллюсков параллельно с активацией детоксикационных процессов.

б) 15-ти суточное воздействие Димоксистробина на уровне минимальной летальной концентрации приводит к срыву адаптационных механизмов, проявившихся в начальные сроки интоксикации, увеличивая его токсичность для рыб.

3. В хроническом эксперименте у ветвистоусых ракообразных происходят необратимые нарушения, связанные с развитием, ростом и репродукцией, в растворах с низкими концентрациями всех исследованных фунгицидов.

4. Стробилурины нарушают пластический обмен у предличинок бестера, снижая их линейный и весовой рост, и обладают выраженным тератогенным действием для эмбрионов и предличинок осетровых рыб.

5. Наиболее чувствительными к действию стробилуринов оказались ветвистоусые ракообразные, эмбрионы и предличинки осетровых рыб.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международная конференция: «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010); Международная научая, конференция «Современное состояние водных биоресурсов и экосистем морских и пресных вод России: проблемы и пути решения» (Ростов-на-Дону, 2010); Седьмая международная научно – практическая конференция молодых ученых по проблемам черного и азовского морей «Понт Эвксинский» (Севастополь, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы водной токсикологии к 100-летию со дня рождения профессора Е.А. Веселова» (Петрозаводск, 2011); IV Всероссийской конференции по водной экотоксикологии «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы» Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН (п.Борок, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в издании из перечня ВАК. Доля участия автора в публикациях составляет 59 % (3,56 п.л.)

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах печатного текста. Состоит из введения, трех основных глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающей 115 источников отечественных и 55 зарубежных авторов. Содержит 35 таблиц и 28 рисунков.

Личный вклад автора в работу заключается в непосредственном выполнении экспериментальных исследований по всем разделам диссертационной работы, проведении анализа и обобщения результатов работы, сбора и систематизации литературных данных. Исследования по эмбриологии и тератогенному анализу осетровых рыб проводились совместно с к.б.н. Щербаковой Н.И. и к.б.н. Катасковой С.И.

Содержание работы

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОЦЕНКИ ПЕСТИЦИДНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ВОДНЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ

В главе освещены общие сведения о пестицидах, классификация их по назначению и химической природе. Приведены материалы об исследованиях нового эффективного класса химических соединений с фунгицидной активностью – стробилуринов. Показан механизм действия и использование этих фунгицидов как эффективных средств борьбы растений с фитопатогенами. Изложены данные научной литературы о физиологических нарушениях у гидробионтов при пестицидном воздействии. Показаны механизмы формирования метаболических нарушений, роль систем антиоксидантной защиты и детоксикации при пестицидной интоксикации.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований

Работа проводилась в отделе рыбохозяйственной токсикологии ФГУП «АзНИИРХ» в соответствии с научно-исследовательскими работами Федерального агентства по рыболовству.

Всего было использовано 25 показателей, проведено 3117 анализов. Объем и направления исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Основные направления и объем исследований



п/п

Направления исследований

Объекты исследований

Пестициды

Показатели

Кол-во анали-зов

1

2

3

4

5

6

1.

Изучения токсического воздействия пестицидов на гидробионтов в остром опыте

Дафнии, моллюски, осетровые и карповые рыбы

Трифлоксистробин, Пираклостробин, Димоксистробин, Флуоксастробин


Выживаемость, поведение, реакции на внешние раздражители

720

2.

Биохимические исследования на гидробионтах

(4 суток)

Катушка роговая (Planorbarius corneus) гомогенат

Трифлоксистробин, Пираклостробин,

МДА; КФ; СОД; КТ; АцЭ; КарбЭ; ГSH; ГР; ГГТ; ГST

1260







Сеголетки карпа (Cyprinus carpio)
а) гомогенат жабр

б) гомогенат печени

Трифлоксистробин, Пираклостробин,

МДА; КФ; СОД; КТ; АцЭ; КарбЭ; ГSH; ГР; ГST
МДА; КФ; СОД; КТ; АцЭ; КарбЭ; ГSH; ГР; ГST; ГГТ

972

972


3.

Биохимические исследования на карповых рыбах

(15 суток)

Сеголетки карпа (Cyprinus carpio)
а) гомогенат жабр
б) гомогенат печени

Димоксистробин


МДА; СОД; КТ; АцЭ; КарбЭ; ГSH; ГST


126


Продолжение таблицы 1

1

2

3

4

5

6

4.

Исследование хронического воздействия на дафний

Дафния (Daphnia magna Straus)

Трифлоксистробин, Пираклостробин, Димоксистробин, Флуоксастробин

1.сроки наступления половозрелости

2.количество пометов

3.плодовитость дафний

4.численность популяции

5.биомасса популяции

6.соотношения возрастных групп в популяции

7.линейный рост

8.вес дафний

5184
5184

5184
2880
720
2880
1440

1440

5.

Оценка токсического действия пестицидов на эмбрионы осетровых рыб

Эмбрионы бестера

(Huso huso L. x Acipenser ruthenus L.)

Трифлоксистробин, Пираклостробин, Димоксистробин, Флуоксастробин

1.Длительность инкубационного периода, скорость прохождения стадий, динамика выклева.

2.Патоморфология

64

480

6.

Оценка токсического действия пестицидов на предличинок осетровых рыб

Предличинки бестера

(Huso huso L. x Acipenser ruthenus L.)

Трифлоксистробин, Пираклостробин, Димоксистробин, Флуоксастробин

1.Морфометрические параметры

а. длина тела

б. масса тела

2.Патоморфология



510

510

645


Объектами исследования являлись представители разных систематических групп водных организмов:

1) ветвистоусые ракообразные - дафнии (Daphnia magna Straus);

2) брюхоногие моллюски – катушка роговая (Planorbarius corneus);

3) карповые рыбы – сеголетки карпа (Cyprinus carpio);

4) осетровые рыбы – эмбрионы и предличинки бестера (Huso huso L. x Acipenser ruthenus L.).

В исследованиях были использованы четыре стробилуриновых фунгицида, являющиеся техническими продуктами (действующие вещества) – Трифлоксистробин, Пираклостробин, Димоксистробин, Флуоксастробин. Первым этапом исследований было проведение острых экспериментов по выживаемости гидробионтов в растворах с различными концентрациями стробилуринов. По окончанию экспериментов проводился расчет основных токсикометрических параметров (Прозоровский, 1962).

Вторым этапом работы явилось исследование воздействия стробилуриновых фунгицидов на уровне минимальных летальных концентраций на процессы ПОЛ, АОЗ, I и II фаз детоксикации у водных организмов. Действие Пираклостробина и Трифлоксистробина на моллюсков и карповых рыб исследовали в течение 4-х суток. Действие Димоксистробина на рыб изучалось в 15-ти суточном эксперименте.

Интенсивность ПОЛ, активность систем АОЗ и детоксикации оценивали в цельных гомогенатах катушки роговой, а также в гомогенатах печени и жабр карпа. В опытах было использовано 12-15 животных на каждый вариант постановки.

Исследования проводили по следующим показателям: определяли содержание вторичного молекулярного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (Стальная, Гаришвили, 1977), активность ферментов антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы (Misra, Fridovich, 1972), каталазы (Королюк и др., 1988), активность лизосомального фермента – кислой фосфатазы (Лабораторные методы исследования…, 1987). О процессах I фазы детоксикации стробилуриновых фунгицидов судили по активности ферментов биотрансформации – ацетилэстеразы (Покровский, Арчаков, 1968) и карбоксилэстеразы (Временные методические указания по методу…, 1987). Состояние глутатионовой системы регистрировали по содержанию восстановленного глутатиона (Ellman, 1959), активности ферментов глутатион-S-трансферазы (Habig et. al., 1974), глутатионредуктазы (Юсупова, 1989), гамма-глутамилтрансферазы (Колб, Камышников,1982). Количество общего белка определяли по методу Лоури (Lowry et. al., 1951).

Третьим этапом работы явилось исследование хронического воздействия стробилуриновых пестицидов на дафний.

Для хронических опытов подбирали 4-5 концентрации веществ, составляющие 0,1-0,0001 от ЛК50 за 96 ч. Рачков рассаживали в стаканы объемом 500 мл по 10 шт. в каждый (3 повторности для каждой концентрации токсиканта и контроля). Температурный режим поддерживался на уровне 22-24 °С. Основными биологическими показателями действия исследованных веществ были выживаемость, сроки наступления половозрелости, общая плодовитость, численность, соотношение возрастных групп популяции, биомасса популяции, длина и вес (Методические рекомендации…, 1998).

Четвертым этапом работы было изучение влияния стробилуринов на эмбриональное и раннее постэмбриональное развитие осетровых рыб.

Степень токсичности различных концентраций изученных веществ на развивающуюся икру оценивали по следующим показателям: выживаемость, длительность инкубационного периода, скорость прохождения стадий. В ходе эксперимента ежедневно проводили учет погибших зародышей, фиксировали стадии развития (Гинзбург, Детлаф 1969).

Хронический эксперимент на предличинках проводили в 2-х литровых емкостях, куда помещали по 60 штук предличинок. На основании результатов острого опыта выбирали концентрации для 6-ти суточного в диапазоне 1/5 ЛК50 – 1/100 ЛК50. Температура воды в среднем составляла 18-19°С. В конце опыта определяли морфометрические показатели: темп роста, массу тела (Методические указания…, 1998).

Тератологический анализ эмбрионов осетровых проводили в течение 4,5 суток до полного выхода организмов из зародышевых оболочек, предличинок – в течение 6-ти суток от выклева до полного рассасывания желточного мешка (Детлаф, Гинзбург и др., 1981).

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработки (Лакин, 1980), используя t-критерий Стъюдента для малых выборок и оценивая резко отклоняющиеся варианты по критерию Шовене (Кокунин,1975). Различия между двумя выборками считали достоверными при р < 0,05.



следующая страница >>